血管内皮祖细胞与基因治疗探析,细胞生物学论文

　　摘要：　随着血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)研究的深入，EPC的分离、体外培养、鉴定及在血管相关性疾病(如缺血性疾病)和各种肿瘤发生发展中的作用及功能已成为新的研究热点。EPC具有分化功能，增殖能力极强，体外扩增培养速度快，主要存在于外周血、脐血、骨髓中，且容易获取，是干细胞移植疗法理想的种子细胞来源。目前，EPC在治疗心脑血管、肢体缺血性疾病等方面的研究十分活跃，并初步取得了肯定的成果。本文主要就EPC在再生医学中的细胞治疗及基因治疗上的应用作一综述。

　　关键词：　内皮祖细胞; 再生医学; 细胞治疗; 基因治疗;

　　Abstract：　With the further study of endothelial progenitor cell(EPC),the isolation,in vitro culture and identification of EPC and their roles in the pathogenesis and progress of vascular diseases such as ischemic diseases as well as various tumors have become the new focus in the field of research. EPC have a differential function and strong proliferation ability and were propagated rapidly in vitro,which mainly exist in peripheral blood,umbilical cord blood and born marrow and is an ideal source of cell seed for stem cell transplantation therapy. At present,EPC were researched actively in the field of therapy of cardiovascular and cerebrovascular diseases and limb ischemic diseases,in which the definite achievements have been obtained. This paper describes the application of EPC in cell therapy and gene therapy in regenerative medicine.

　　Keyword：　Endothelial progenitor cell(EPC); Regenerative medicine; Cell therapy; Gene therapy;

　　再生医学是一个涉及干细胞、组织工程、细胞与分子生物学、发育生物学、生物化学等多个学科领域的新兴学科，是通过研究机体的正常组织特征及功能、创伤修复及再生机制和干细胞分化机制，寻找有效的生物治疗方法，促进机体自我修复及再生，或构建新的组织及器官，以改善或恢复损伤组织和器官功能的学科，主要包括干细胞、组织工程、细胞治疗、器官移植等多个研究领域。近年来随着细胞生物学尤其是干细胞生物学的飞速发展，细胞治疗在基础研究领域取得了很大的进展，部分基础研究成果已开始在心血管系统疾病、神经系统疾病、肌肉骨骼相关疾病、糖尿病等多种疾病的临床试验中得到应用，并取得了初步的研究成果，展示了广阔的临床应用前景。血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）作为治疗缺血性疾病的候选细胞，具有易于从外周血中获得、有效的血管生成和血管生成效应、血统的稳定性和较低的致瘤性等特征，这些特征引起了许多关于其治疗性新血管形成的可能效用的研究。造血EPC由于其利于提取和分离，利于体外培养和扩增，在这些应用中具有一定的潜力。

血管内皮祖细胞与基因治疗探析

　　1 、细胞治疗

　　1.1、 EPC移植治疗缺血性心脏病

　　1.1.1 、经冠状动脉移植

　　2010年，SEN等[1]通过体外扩张，对骨髓源性EPC的再生潜力进行了调整，以治疗心肌缺血。他们通过有效的基因改造来提高EPC的功能，在大鼠心肌梗死模型中，利用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）扩大和转导周围的血液EPC。通过左前降冠状动脉阻塞而心肌梗死的成年大鼠，接受经冠状动脉移植的AAV-IGF-1转导的自体EPC，结果显示，表达IGF-1的EPC导致心肌细胞凋亡减少，心肌细胞增殖增加，梗塞部位毛细血管数量增加。因此，经冠状动脉移植的表达IGF-1的EPC在大鼠心脏梗塞中表现出良好的细胞保护作用。2015年，LEE等[2]提出一个假设，即对于不适合进行冠状动脉介入治疗的严重弥漫性冠状动脉疾病患者的缺血相关性左心室功能障碍，可通过来源于外周血的循环式自体CD34+细胞内冠状动脉输血得到改善。他们进行了一系列的临床试验，以测试两种不同浓度的CD34+细胞在严重弥漫性冠状动脉疾病中治疗的有效性和安全性，并同时验证了来源于外周血的循环式自体CD34+细胞内冠状动脉输血的细胞疗法对于不适合冠状动脉介入治疗且药物疗法反应差的严重弥漫性冠状动脉疾病患者的心功能是否是安全有效的。在研究中，纳入了38例患有严重弥散性冠状动脉疾病的患者，并随机分为2组，分别经冠状动脉注射浓度为1.0×107和3.0×107个的CD34+细胞，通过随访和调查后，结果显示，经冠状动脉移植CD34+细胞后，两组患者冠状窦血液样本中的EPC含量高于外周血液，左心室射血分数增加，心绞痛和心力衰竭得到改善。因此，经冠状动脉移植的CD34+细胞疗法对于不适合冠状动脉介入治疗且药物疗法反应差的严重弥漫性冠状动脉疾病患者的心功能是安全有效的。

　　1.1.2 、经心外膜心肌注射移植

　　2014年，KAMATA等[3]通过实验证实了伴随EPC心外膜心肌注射诱导移植的心脏干细胞在治疗慢性缺血性心肌病中，比用心脏干细胞单独治疗，能够进一步促进新生血管的形成和心肌纤维化的减少，说明伴随EPC心外膜心肌注射的心脏干细胞对慢性缺血性心肌病的治疗效果较单独移植心脏干细胞更安全有效。QUAN等[4]通过一系列试验研究了胸腺素β4(Tβ4）对Tβ4处理的EPC在梗塞心肌中经心肌内注射后对血管生成和心脏功能的影响。他们从成年雄性大鼠的骨髓中分离EPC，并在内皮基础培养基-2中孵育，然后分别用浓度0.05、0.1和0.2μmol/L的Tβ4处理细胞，同时用DMEM孵育的细胞作为对照，结果表明，Tβ4能够增强EPC的活力，促进细胞增殖和迁移以及细胞内毛细血管样结构的形成，还能增加细胞中p-Akt的表达，经Tβ4处理的EPC可改善心肌功能，增强梗塞心肌的修复，促进梗死心肌移植后的血管新生，因此，用Tβ4预处理EPC可能是心肌梗死移植后缺血组织修复的新策略。但经心外膜心肌内注射EPC移植诱发室性心律失常的风险尚需进一步观察。

　　1.1.3 、经心内膜心肌注射移植

　　2015年，PREMER等[5]提出了间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）能够增加EPC的功能和恢复血流介导的血管舒张的假设。在研究中，特发性扩张和缺血性心肌病患者被随机分配接受自体或同种异体的MSC，比较了MSC经心内膜注射前后3个月以及健康对照组的EPC-集落形成单位及血管舒张功能和血管内皮生长因子的循环水平，结果显示，MSC能够导致功能性EPC的增殖和血管反应性的改善，从而使心力衰竭患者的内皮功能恢复正常。

　　1.1.4 、外周血管内注射移植

　　EPC经外周血管内注射移植的优点包括移植简单、易行、不需要复杂设备和技术以及可通过血液循环定期、定时、持续向缺血病变部位进行移植，从而维持缺血组织有效的EPC浓度提高疗效。研究表明，集落细胞刺激因子[6]、血管内皮生长因子[7]等细胞因子以及血管紧张素转换酶抑制剂[8]、促红细胞生成素[9]、他汀类调脂药[10]、银杏叶提取物[11]等均具有动员EPC的功能，如HONOLD等[12]对慢性心衰患者注射集落细胞刺激因子后发现，集落细胞刺激因子不仅可使造血干细胞及EPC在外周血中的数量增加，还有促进EPC的心肌再生及新生血管形成的功能。

　　1.2、 EPC预防支架术后再狭窄

　　在再生医学中以EPC为中心的另一个主要研究课题是围绕心血管应用的捕获支架，其将EPC从血液循环中隔离出来，以促进裸露的腔表面的内皮化。捕获是由固定化抗体在支架表面产生的，通常是针对CD34。近年来的研究表明[13]，抗体结合已经被证明可以钝化表面，减少血小板黏附和凝血效应以改善血液相容性检测。

　　在EPC捕获支架上进行的随机临床试验表明其是安全有效的，同时通过上市后的监测，并无证据表明使用后不良心脏事件的风险增加[14]。与药物洗脱支架（drug-eluting stents,DES）相比，EPC捕获支架与晚期管腔丢失和靶血管衰竭有关，但晚期支架内血栓形成的发生率降低。OrbusNeich生产了新一代EPC捕获支架“COMBO”，其将西罗莫司洗脱180 d，从而将DES的功效与“生物工程支架”的长期安全性结合起来[15]。目前，为了满足快速内皮化的需要，有研究者认为应该专门针对晚期EPC甚至是循环EC，而涂有抗CD309或CD144抗体的表面与改善的内皮化结果有关。2015年，CHEN等[16]进一步修改了捕获表面，以促进捕获细胞的转染，通过提出一种适体-siRNA嵌合体修饰的组织工程血管，使其可以在糖尿病中保持通畅性，这种组织工程血管由CD133-腺苷激酶（adenosine kinase,A.DK）嵌合体和支架组成，最终的实验结果显示，CD133-ADK嵌合体可以在体内选择性捕获CD133阳性细胞，捕获的细胞可以内化结合的嵌合体以实现RNA自身转染，转染后的Si RNA可抑制CD133阳性细胞凋亡，从而导致了腺苷的上调，改善了EPC的功能。WOUDSTRA等[17]通过研究评价了组合支架使用1年的安全性和临床结果，报告纳入了2013年6月～2014年3月间，共1 000例患者，应用同时携带雷帕霉素生物可降解涂层和CD34+抗体涂层的新型生物组合支架，募集EPC以促进血管重塑，从而防止内膜增生和再狭窄。结果显示，出现急性冠状动脉综合征的患者占49.9%，发生靶病变失败率（target lesion failure,TLF）的患者占5.7%，发生心源性死亡的患者占1.7%，靶血管心肌梗死（myocardial infarction,MI）和靶病变血运重建（target lesion revascularization,TLR）发生率分别为0.7%和4.4%，支架内血栓形成的患者占0.5%。该研究表明，在患者中应用新型组合生物支架1年的临床结果理想。用于捕获和阐明EPC的分化和功能中的主要信号传导网络的更清晰的表面抗原定义，可能为EPC捕获支架提供更合理的设计。然而，管腔表面的再生仍然是血管组织工程中的关键问题，大多数努力集中于在植入前用内皮细胞“预置”腔表面。但研究表明，这种体外内皮化方法需大量时间和较高成本，因此是不切实际的。鉴于此，目前许多研究活动均集中在采用、开发和改进血管移植的EPC捕获技术上。

　　1.3 、EPC治疗缺血性脑血管病

　　MEAMAR等[18]通过试验评估了循环EPC在短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack,TIA）患者中对未来脑血管（cerebral vessels,CV）事件的作用，在试验中，纳入了30名连续的TIA患者和30名健康志愿者。30名患者连续TIA 24 h后，使用流式细胞术测定循环EPC水平，同时也对30名健康志愿者EPC水平进行了评估，在12个月的时间内，所有患者由经验丰富的神经科医师评估由CV疾病引起的复发性TIA、中风或死亡。结果显示，与对照组相比，TIA首次发作后患者组循环EPC增加，且在第1次TIA发作中，EPC升高的患者未发生未来CV事件的发生率增加。LI等[19]证实了转染脂联素基因的EPC联合移植物移植至脑缺血大鼠模型中，可改善大鼠大脑中动脉闭塞后的功能恢复，同时也说明了基因修饰的细胞疗法可能对治疗缺血性中风有效。MORANCHO等[20]报道，组织基质金属蛋白酶9能够影响缺血后EPC诱导的血管生成，其在中风后EPC诱导的血管重塑中起关键作用。GENG等[21]通过实验探讨了在糖尿病小鼠脑缺血后，EPC移植对血脑屏障完整性的影响。在实验中，糖尿病小鼠经历90 min短暂性大脑中动脉闭塞手术，并在再灌注后立即接受1×106EPC移植，然后检测脑梗塞体积、血脑屏障通透性、紧密连接蛋白表达和缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）mRNA水平。结果显示，与对照组相比，短暂性脑缺血后EPC移植的糖尿病小鼠的神经功能缺损减弱，脑梗塞体积减少，血脑屏障渗漏和紧密连接蛋白降解减少，同时，EPC也上调了HIF-1α表达。表明EPC可通过上调HIF-1α信号传导来保护糖尿病小鼠局灶性缺血后的血脑屏障完整性。PENA等[22]检测了粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）在减少延迟组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator,tPA）诱导的出血性转化（hemorrhagic transformation,HT），脑梗塞和血栓栓塞（thromboembolism,TE）中风模型中的神经功能缺损方面的功效，以及G-CSF的作用是否持续更长时间恢复期。在中风诱导后6 h，分别给大鼠静脉注tPA(10 mg/kg）或G-CSF(300μg/kg)+t PA，并以生理盐水作为对照，结果发现，G-CSF使延迟的tPA相关HT减少了47%，梗塞体积减少了33%，运动和神经功能缺损分别减少了15%和25%；同时，免疫组化结果显示，缺血皮质和纹状体中EPC标记物CD34+和VEGFR2分别富集1.5和1.8倍；另外，流式细胞术结果显示，给予G-CSF的大鼠外周血中CD34+细胞的动员增加。这些结果证实，G-CSF能够通过增强EPC动员来提高tPA治疗时间窗口的有效性。CHEN等[23]研究证实，通过颈内动脉输注来自自体外周血的EPC，可减少大鼠的大脑梗塞区和急性缺血性卒中后神经功能缺损大脑中动脉闭塞。

　　最近，PENG等[24]对经过14 d冷驯化期后幼年和老年小鼠进行永久性脑缺血，并进行组织学分析和行为测试，分离小鼠EPC，测定其功能和数量，来研究EPC移植对脑缺血损伤的影响。结果显示，脑缺血发作前的预防性冷驯化能增加EPC功能，促进缺血性脑血管生成，保护免受脑缺血性损伤，并改善幼鼠的长期中风结果；此外，与来自对照小鼠的EPC相比，来自冷暴露小鼠的移植EPC具有更强的减少脑缺血损伤和促进局部血管发生的能力，同时，预防性冷驯化还可增强EPC功能，促进局部血管生成，并预防老年小鼠的脑缺血性损伤。因此，缺血发作前的预防性冷驯化能够部分地通过促进EPC的修复功能改善小鼠的长期中风结果，且频繁冷暴露的室内环境变化可能有利于中风的高风险人群。

　　2、 EPC与基因治疗

　　2.1、 EPC转染VEGF

　　MENG等[25]用重组的腺病毒-VEGF-165(Ad-VEGF-165）转染EPC后将其移植至通过部分结扎下腔静脉导致慢性静脉血栓形成的大鼠模型中，来探讨干细胞移植与基因转染对慢性静脉血栓形成的协同治疗作用，结果显示，移植转染后的EPC组表达的VEGF mRNA水平最高，再通毛细血管密度明显升高，对慢性静脉血栓的再通有加速作用。WANG等[26]利用VEGF-165转染EPC观察其对肢体缺血家兔新生血管形成的影响，结果显示，成功转染VEGF-165的EPC，其增殖不受转染影响，与EPC未转染VEGH-165组相比，转染组VEGF上清蛋白浓度水平及毛细血管密度明显升高，对兔肢体缺血的被VEGH-165转染的EPC移植反应明显好于单独EPC移植。

　　2.2、 EPC转染e NOS

　　CUI等[27]通过实验证实了EPC中eNOS的过表达增强了对新内膜增生的抑制，并恢复了受损血管中内皮依赖性血管舒张，移植过表达eNOS的EPC可通过抑制新内膜增生和恢复血管功能来修复受损血管。DANG等[28]利用脂质体介导eNOS体外转染小鼠骨髓来源的EPC，结果表明，转染48 h后，EPC中e NOS表达量明增加，NO含量明显升高，ROS含量明显降低，脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC，并能在EPC中有效表达。

　　2.3、 EPC转染端粒酶逆转录酶

　　ZHANG等[29]将端粒酶逆转录酶转染的EPC移植至经历过6次全肾切除术的大鼠模型中，证实了转染后的EPC能够改善肾功能，减少管周微血管的损失，并抑制肾间质纤维化的进展。

　　2.4、 EPC转染其他基因

　　SONG等[30]用肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）转染EPC观察HGF转染对EPC增殖、迁移和血管生成的影响，以及转染的EPC对高胆固醇血症大鼠球囊诱导的动脉损伤后新内膜形成的影响。研究结果显示，用HGF转染的EPC可释放出高水平的可溶性HGF蛋白，同时也增强了EPC的增殖、迁移和血管生成能力，转染后的EPC在大鼠模型中能够更有效地减少新内膜形成和增加再内皮化。因此，HGF转染EPC可能是预防血管损伤后新内膜形成的实用且有希望的疗法。CAO等[31]用人缺氧诱导因子-1α（human hypoxia-inducible factor-1α，hHIF-1α）转染EPC，并将转染后的EPC移植至成功构建的患有肺动脉高压（pulmonary hypertension,PAH）的兔模型中，在其移植至兔2周后，应用导管插入术来收集血液动力学数据，同时通过测量右心室肥大指数、内侧壁厚度和内侧壁区域来评估右心室肥大和肺血管重塑。蛋白印记法和免疫组化分析用于检测肺小动脉中hHIF-1α的表达。结果显示，在转染EPC移植2周后，收缩期肺动脉压和平均肺动脉压均减弱；右心室肥大和肺血管重塑被逆转；此外，hHIF-1α在移植的转染EPC中表达增高，肺小动脉的数量增加。表明用HIF-1α转染的EPC治疗PAH可能是一种安全有效的方法。HU等[32]将基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）转染至EPC中，并将转染后的EPC移植至脑梗死大鼠模型中，结果显示，VEGF165和SDF-1的共表达改善了脑梗死大鼠的神经功能，减少了脑梗塞体积，增加了微血管密度，促进了缺血半影中的血管生成，改善了脑血流量和灌注，因此，VEGF165和SDF-1基因联合治疗可能是改善脑梗死后血管重塑和恢复神经功能的潜在策略。LI等[33]研究了趋化因子CXCL12转染后的EPC在缺血性中风小鼠模型中的作用，结果显示，CXCL12-EPC治疗在脑缺血后5周显着减少了小鼠脑萎缩并改善其神经行为功能，血管密度和髓鞘完整性增加，促进神经形成，血管生成，CXCL12转染的EPC在治疗缺血性中风方面具有巨大潜力。KE等[34]用表达β2AR的腺病毒血清转染人EPC，结果表明，转染后的EPC过表达β2AR可增强体外EPC功能，并通过β2AR/Akt/eNOS途径增强体内EPC的血管修复能力。

　　3、展望

　　综上所述，目前关于EPC在治疗缺血性心脏病、预防支架术后再狭窄、治疗缺血性脑血管病及肢体缺血性疾病等方面的研究均取得了一定的进展，给缺血性疾病患者的治疗带来了希望。相信随着EPC在再生医学研究中的不断深入，在不久的将来，EPC有希望成为治疗缺血性疾病的又一利器。

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