对我国荷斯坦牛乳腺不同发育阶段乳腺内大分子成分变化分析

　　乳腺发育过程涉及许多种细胞的参与及协同作用。乳腺细胞内大分子成分主要有糖类、脂类和蛋白质等三大类，它们也是乳汁主要组成成分。乳汁是乳腺生理活动的产物，乳汁中含有初生幼仔生长发育所必需的营养物质。乳汁成分复杂，都含有水、蛋白质、脂肪、糖、无机盐等。

　　季节、年龄、胎次、泌乳期、个体特性等，都能影响乳汁成分。乳中的蛋白质主要包括3类，即酪蛋白、乳清蛋白和微量蛋白。它们除能供给机体营养，还具有保护、物质运输、控制代谢、输送氧气、防御病菌的侵袭、传递遗传信息等功能。乳中脂类主要是三酰甘油，约占乳脂的98%。乳中无机盐有主要包括钠、钾、钙、镁的氯化物，磷酸盐、铁等。这些物质在乳中的含量有很大差异，在体内都各自具有特殊的生理功能，缺乏时常引起特殊疾病。

　　本研究采用经典组织化学方法结合生物显微图像分析软件，系统地对不同发育时期中国荷斯坦牛乳腺中大分子成分变化进行分析，可有效提高乳产量和质量。为进一步研究中国荷斯坦牛的泌乳机制及其泌乳机能分化规律和选育优良性状提供形态学资料与理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试验动物

　　试验动物来自于黑龙江省（国家级）畜牧业科技园区。选取健康雌性中国荷斯坦牛30头。检测无乳腺炎及其他疾病。采样时点为：青春期360、420d；妊娠期60、180、260d；泌乳期7、60、280d；退化期3、30d，共计10个时点。每个采样时点选取3只奶牛作平行，每次试验至少重复3次。奶牛处死后，用灭菌手术刀分离乳腺组织，立即置于10%甲醛水溶液固定备用。

　　1.1.2样品采集与制备

　　乳腺组织采集后，迅速转入冻存管中，液氮冻存后转入-80℃冰箱备用。将固定好的各时期组织块修整标号后，用流水冲洗后，乙醇梯度脱水，丙酮、二甲苯透明；56℃蜡箱浸蜡，石蜡包埋，修块；切片（4~5μm）、展片、粘片、烘干备用。

　　1.2方法

　　1.2.1过碘酸-Schiff反应（PAS）显示乳腺中糖类的变化

　　将标记好的乳腺组织冰冻切片用过碘酸水溶液处理；染色、漂洗、复染、梯度脱水、封片。显微镜观察、照像。对照片不经过碘酸处理，直接进入染色流程，则反应呈阴性或明显减弱。

　　1.2.2油红O染色法显示乳腺中脂类的变化

　　取标记好的乳腺组织冰冻切片固定、漂洗、油红O染液浸染、复染、封片。显微镜观察、照像。

　　1.2.3茚三酮-Schiff反应显示乳腺中蛋白质的变化

　　将标记好的乳腺组织冰冻切片固定、置入0.5%茚三酮液中处理、切片取出后流水冲洗、染色、漂洗、冲洗、复染、1%盐酸酒精分化流水冲洗、梯度脱水、封片。显微镜观察、照像。对照片不经茚三酮液处理，直接进入Schiff试剂染色流程，则反应呈阴性或明显减弱。

　　1.2.4图像采集、处理与分析

　　本研究应用LeicaDLMB-2显微镜观察、照像，每个重复3次，每张切片选取5个视野观察，最后用Image-proplus6.0软件对采集的图像进行处理与分析。

　　2、结果与分析

　　2.1过碘酸-Schiff反应（PAS）显示乳腺中糖类的变化

　　青春期中国荷斯坦牛乳腺内分布许多导管，紫色信号大都分布在导管周围的结缔组织中，此时乳腺内糖类主要为糖蛋白和蛋白聚糖（见图1a，图1b）。妊娠60日，PAS阳性信号大多出现在腺泡间的结缔组织中，但腺泡和小叶间结缔组织明显变薄（见图1c）。妊娠180日，PAS阳性仍主要出现在结缔组织中，腺泡腔内阳性信号很难判断（见图1d）。妊娠260日，整个腺泡腔因为分泌物的增加而膨胀变大，腺泡腔部分内容物呈现紫色的PAS阳性反应。小叶间结缔组织中阳性信号明显，但面积逐步减少（见图1e，图1f）。泌乳期乳腺的发育分化完全，腺泡上皮细胞分泌特征明显，腺体的大部分都是充盈饱满的腺泡腔（见图1g，图1h）。腺泡腔中内容物的PAS阳性信号非常强（见图1i，图1j）。乳腺进入退化期，腺泡上皮细胞逐渐凋亡，其泌乳活动也逐步停止。退化3日，逐渐萎缩的腺泡腔内还可见明显减弱的PAS阳性信号，结缔组织中阳性信号逐步增强（见图1k）。退化30日，只有小部分残留的腺泡腔内还可见较弱的PAS阳性信号，腺泡腔内主要为大的脂肪颗粒，结缔组织中阳性信号进一步增强扩大，PAS阳性信号大多分布在乳腺间质中（见图1l）。

　　2.2油红O染色法显示乳腺中脂类的变化

　　青春期乳腺，乳导管开始生长逐渐延伸变厚且分支增多，外面包围着很厚的小叶间结缔组织，逐渐侵入脂肪组织。橙色着染的空泡状的大脂肪细胞是青春期乳腺的主体结构（见图2a，图2b）。妊娠期乳腺最显著的变化就是腺泡腔逐渐出现，小叶内腺泡数量逐渐增多，大脂肪细胞逐渐消失。妊娠180d时大脂肪细胞完全消失（见图2c，图2d）。到妊娠260d时腺泡上皮细胞内出现大量脂滴，并有少量脂滴分泌至腺泡腔内（见图2e，图2f）。泌乳期乳腺发育分化完全，大量的脂滴从腺泡上皮细胞内泌至腺泡腔，使腺泡腔变得充盈饱满（见图2g，图2h，图2i，图2j）。乳腺进入退化期时脂肪组织发生剧烈的变化。退化3d时只有腺泡上皮细胞内有脂滴，腺泡腔里则没有（见图2k）。退化30d，腺泡的大小和轮廓出现剧烈变化，形状变得不规则，小叶间结缔组织密度增加，脂滴相互融合形成大的空泡状脂肪细胞。

　　脂肪细胞重新分化，并与结缔组织一起围绕着重组后明显减少和缩小的腺泡结构（见图2l）。完全退化的乳腺主要由脂肪细胞组成，腺体重新呈现成熟未妊娠状态。

　　2.3茚三酮-Schiff反应显示乳腺中蛋白质的变化

　　青春期乳腺大部分都是以脂肪和结缔组织，乳腺实质部分较少。光镜下可见紫红色的阳性信号大都分布在导管周围的结缔组织中（见图3a，图3b）。妊娠期乳腺加速生长分化，腺泡上皮细胞快速增殖。腺泡结构日趋成熟，腺泡腔出现并逐渐变大，但在妊娠60d，紫红色的阳性信号大都分布在腺泡芽周围的结缔组织中（见图3c）。妊娠180d，阳性信号仍大都份出现在小叶间结缔组织中，腺泡腔逐渐扩大，腔内可见微弱阳性信号（见图3d），直到妊娠260d，腺体内出现成熟独立的腺泡。腺腔内可见强烈的紫红色阳性信号，腺泡腔逐渐膨胀饱满（见图3e，图3f）。泌乳期乳腺内布满分化完全的成熟腺泡结构，腺体的大部分都是充盈的腺泡腔，腺泡腔内呈现紫红色阳性信号，腺泡上皮细胞分泌活动旺盛（见图3g，图3h，图3i，图3j）。

　　乳腺进入退化期后，腺泡上皮细胞开始凋亡，泌乳活动也逐步停止。退化3d结缔组织中阳性信号逐渐增强，缩小变形的腺泡腔内有减弱的阳性信号（见图3k）。退化30d，脂肪组织和结缔组织等间质大量增生，结缔组织中阳性信号进一步增强扩大，只有部分残留的腺泡腔内还可见较弱阳性信号，腺泡腔内主要为大的空泡状脂肪颗粒。腺泡结构已基本消失，阳性信号大多分布在乳腺间质中（见图3l）。

　　3、讨论

　　3.1乳腺中糖类的变化规律

　　乳腺中的糖类主要包括乳糖和糖复合物。乳糖是乳中糖类的主要组成成分，乳糖是牛奶中最为丰富的糖类，不同动物乳中的乳糖含量不同，牛乳中糖类有99.8%是乳糖。显示糖类最常用的组织化学方法是过碘酸-Schiff反应（PAS）。过碘酸-Schiff反应（PAS）的反应基础是利用过碘酸的氧化作用，过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，醛基再与Schiff试剂中的碱性品红形成紫色化合物，达到染色目的。

　　PAS反应同样对含有CHOH-CO、CHOH-COOH、CHOH-CHNH2的糖蛋白、蛋白聚糖等大分子具有氧化作用，释放醛基。值得注意的是过碘酸和Schiff试剂浓度、作用时间、pH、温度等对PAS结果的强度都会有所影响。青春期乳腺导管系统虽已形成，但乳腺基本不发育。本研究中乳腺内分布着许多导管，紫色的PAS阳性信号大都分布在导管周围，此时乳腺内糖类主要为糖蛋白和蛋白聚糖等糖复合物，说明乳腺间质大量增生，腺体内主要以脂肪和结缔组织为主。妊娠期初期乳腺内腺泡腔开始出现，PAS阳性信号大多出现在腺泡间的结缔组织中，表明此时乳腺内糖类仍主要为糖复合物。但腺泡和小叶间结缔组织明显变薄，说明此时期腺泡芽大量增生，乳腺间质逐步减少。妊娠中期腺泡逐渐发育，腺泡腔逐渐扩大，PAS阳性信号显示的仍主要为结缔组织中的糖蛋白和蛋白聚糖。尽管有报道显示合成乳糖所需酶在妊娠中期已出现，但本研究中很难判断此时有乳糖的表达，即便有分泌也是微量。而到妊娠260d腺泡分泌特性明显，腺泡腔部分内容物呈现紫色的PAS阳性反应，表明此时期乳腺内糖类主要为腺泡腔内的乳糖。糖蛋白和蛋白聚糖成分阳性信号明显，但面积逐步减少。泌乳期乳腺腺泡腔内有大量乳糖颗粒堆积，腺泡腔内容物的PAS阳性信号要强于妊娠晚期，表明乳糖的分泌表达逐渐达到顶峰。乳腺进入退化期后，腺泡上皮细胞的泌乳活动也逐步停止。

　　退化3d乳腺内腺泡腔内容物的PAS阳性信号强度逐渐降低，表明乳糖分泌随泌乳活动逐步停止。

　　同时结缔组织中糖蛋白和蛋白聚糖成分阳性信号逐步增强，表明乳腺间质逐渐增生。退化30d腺体内腺泡结构基本消失，PAS阳性信号大多分布在增生乳腺间质中，此时乳腺内糖类与青春期基本一致，主要为糖复合物。

　　3.2乳腺中脂类的变化

　　中脂类可分为贮存脂（Storagelipid）和结构脂（Structurallipid）。乳腺中贮存脂为三酰甘油，它是乳脂主要组成，主要贮存在脂肪细胞内。乳腺中的结构脂包括糖脂、磷脂、固醇，它们是构成各种生物膜的脂双层骨架。在乳腺发育过程中腺泡上皮组织和脂肪组织变化最大。油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。本研究采用油红O染色和细胞核复染定位法检测中国荷斯坦牛乳腺组织，在细胞水平观察乳腺发育中脂类的产生和表达变化情况。

　　本研究中青春期中国荷斯坦牛乳腺绝大部分都为脂肪组织，富含三酰甘油的空泡状大脂肪细胞被油红O染成橙色。乳腺进入妊娠期后，随着腺泡的逐步发育分化，大脂肪细胞逐渐消失，妊娠60d中国荷斯坦牛乳腺只有很少量的大脂肪细胞。

　　妊娠180d时大脂肪细胞完全消失，腺泡上皮细胞内出现大量脂滴，并有少量脂滴分泌至腺泡腔内。泌乳期乳腺发育分化完全，大量脂滴从腺泡上皮细胞内分泌至腺泡腔形成乳脂，使腺泡腔便道充盈饱满。有研究显示此时约30％腺体仍分布有脂肪细胞，且一部分为多泡脂肪细胞，可能要归因于腺泡上皮细胞利用脂肪而引起的脂肪动员。乳腺进入退化阶段，脂肪组织发生剧烈变化。退化3d乳腺内只有腺泡上皮细胞内存有脂滴，腺泡腔则没有。此后腺体内脂滴开始相互融合形成大的空泡状脂肪细胞。退化30d脂肪细胞重新分化，完全退化的乳腺内主要由大的空泡状脂肪细胞组成，腺体重新呈现性成熟未妊娠状态。

　　研究表明，作为乳腺形态形成的最后一个阶段，腺泡发育过程与乳腺泌乳机能的分化过程相互交叉密不可分。小鼠乳腺泌乳机能的分化可分为两个阶段，第一阶段在妊娠中期开始，各种乳蛋白基因持续表达，合成增加，如乳清蛋白、β-酪蛋白等，这阶段在形态学上表现为腺泡上皮细胞内出现大量脂滴；第二阶段在分娩前后，各种乳蛋白基因继续高表达而在形态学上的表现为腺泡上皮细胞间连接更加紧密，腺泡上皮细胞内的脂滴和酪蛋白分泌至腺泡腔内。本研究结果显示中国荷斯坦牛乳腺泌乳机能分化的第一阶段始于妊娠晚期，第二阶段发生在分娩后泌乳开始。这一结果与关中奶山羊乳腺发育与泌乳机能分化过程相似，这也从形态学上证明，反刍类动物乳腺泌乳机能的分化与啮齿类动物存在一定的差异。

　　3.3乳腺中蛋白质的变化

　　本研究中青春期和妊娠期初期中国荷斯坦牛乳腺内，紫红色的阳性信号大都分布在导管和腺泡芽周围的结缔组织中，此时乳腺内蛋白质主要为糖蛋白和蛋白聚糖，这也表明此时期腺体内以乳腺间质为主，乳腺上皮细胞较少。妊娠中期，腺泡腔逐步扩大，阳性信号仍大都份显现于小叶间结缔组织中，但腺泡腔内可见微弱阳性信号，表明此时期乳腺内蛋白质主要仍为糖蛋白和蛋白聚糖，同时有少量乳蛋白分泌表达。而在妊娠晚期，整个腺泡腔内均呈现紫红色的阳性信号，说明此时期随着腺泡分泌活动的增强，乳腺内蛋白质逐渐以乳蛋白为主。这种现象贯穿整个泌乳期。退化3d腺泡腔内阳性信号强度逐渐降低，同时间质中阳性信号逐步增强，表明乳蛋白的分泌逐步减弱，乳腺间质逐渐增生。退化30d腺体内阳性信号大多分布在增生的乳腺间质中，此时乳腺内蛋白质表达基本恢复到妊娠前状态，主要为糖蛋白和蛋白聚糖。

　　4、结论

　　a.中国荷斯坦牛乳腺发育过程中青春期乳腺主要为富含三酰甘油的脂肪组织，妊娠期和泌乳期，大脂肪细胞逐渐消失，大量脂滴逐渐出现。退化期腺体内脂滴开始相互融合成大的空泡状脂肪细胞，重新呈现成熟未妊娠状态。

　　b.中国荷斯坦牛乳腺发育过程中，青春期、妊娠初中期和退化期乳腺中的糖类以糖蛋白和蛋白聚糖为主，妊娠晚期和泌乳期以乳糖为主。

　　c.中国荷斯坦牛乳腺发育过程中乳腺中的蛋白质以糖蛋白和蛋白聚糖为主；妊娠中晚期和泌乳期以乳蛋白为主。