NF-κB对凋亡相关基因表达的调节作用研究,细胞生物学论文

　　Kerr 等[1]在 1972 年首次提出了细胞凋亡的概念，从此开启了对细胞凋亡的探索之路。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主有序的主动死亡过程，又称程序性细胞死亡，以细胞固缩、染色质浓集、凋亡小体的形成及细胞核 DNA 片段化为主要的形态特征，其信号转导机制复杂，主要包括 3 条通路，即细胞内的线粒体通路、内质网通路和细胞外的死亡受体通路[2].

　　NF-κB 是细胞核内重要的转录调节因子，不仅参与机体免疫、炎症、组织损伤修复和胚胎发育等过程，还可以调节凋亡相关基因的表达[3].研究表明，NF-κB与多种凋亡相关基因的易感性与耐药性密切相关，在细胞存活与凋亡过程中起到双刃剑的作用[4].

　　1 NF-κB 概述

　　1.1 NF-κB 家族

　　NF-κB 是 NF-κB /Rel 蛋白家族成员之一，目前在哺乳动物中已发现有 5 种 NF-κB /Rel 蛋白，包括 p50（又称为 NF-κB 1,由前体蛋白 p105 产生）、p52（又称为 NF-κB 2,由前体蛋白 p100 产生）、RelA（ p65） ,RelB 和 c-Rel.每一个 NF-κB /Rel 蛋白家族成员的 N 端都含有 Rel 同源结构域，包括核定位信号序列、二聚化区域、DNA 结合区和 IκB 结合位点。p65,RelB 和 Rel 的 C 端含有转录激活域，其中富含丝氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用于转录元件并激活转录过程。除了 p52和 p50 外，这些蛋白两两结合成具有 NF-κB 活性的不同转录因子复合物，其中 p65/p50 是存在最广泛且是目前研究最多的二聚体复合物。

　　1.2 NF-κB 的激活

　　NF-κB 的激活途径主要包含经典途径和旁路途径[5-6].细胞在静息状态时，NF-κB 通常以非活性的 p65/p50/NF-κB 抑制因子 α （ inhibitor ofNF-κB-α，IκB-α）三聚体复合物形式存在于细胞质中，三聚体复合物可以被多种因素激活，包括细胞因子如白细胞介素 6（ interleukin-6,IL-6）和 IL-17、肿瘤坏死因子 α（ tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细菌内毒素脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS）、蛋白激酶 C 和理化因素（ X 射线、氧化剂及化疗药物制剂）等。在上述激活物的刺激下，细胞中 IκB 激酶 β（ IκB kinase β，IKKβ）发生磷酸化，进而磷酸化 IκB氨基端丝氨酸残基的第 32 和第 36 位点，磷酸化的IκB 被泛素酶泛素化，随后发生构象改变并降解，导致 NF-κB 的核定位信号序列暴露，并易位到细胞核，与下游靶基因的增强子位点结合，从而启动靶基因的转录和表达，这是目前研究最清楚的经典途径。旁路途径局限于淋巴器官，仅少部分刺激物（如淋巴毒素β 等）通过该途径激活 NF-κB,由 NF-κB 诱导激酶（ NF-κB inducing kinase,NIK）介导 IKKα 激活，进而使前体蛋白 p100 降解生成 p52,与 RelB 形成异源二聚体，进入细胞核与靶基因结合并启动其表达[7].

　　此外，尚存在不规则的 NF-κB 激活途径，此途径是在 DNA 损伤的细胞中发现的。细胞受到紫外线照射或抗肿瘤药物等刺激后，引起 DNA 损伤，p38 丝裂原激活蛋白激酶（ p38 mitogen-activatedprotein kinase,p38MAPK ）激活酪蛋白激酶 2（ casein kinase 2,CK2） ,后者介导 IκBα 磷酸化，引起 IκBα 泛素化后降解，继而激活 NF-κB,以类似经典途径的方式，诱导下游靶基因表达。因此，p38-CK2-IκBα也是激活 NF-κB 的途径之一[8].

　　NF-κB 活化的调节方式有正反馈调节和负反馈调节[9].细胞在外界刺激作用下，活化的 NF-κB 激活 IL-1β 和 TNF-α 等，这些基因表达上调后反向活化NF-κB,进一步刺激 IL-6 和 IL-8 等释放，导致炎症信号放大[10],此过程为正反馈调节。NF-κB 的负反馈调节存在于细胞内和细胞外。细胞内 NF-κB 活化促进 p105 和 IκBα 的表达上调，一定程度上限制了NF-κB的活化速度；同时，p50 的同源二聚体增加，与有转录活性的 NF-κB 竞争 DNA 结合位点，降低 NF-κB介导的炎症效应。细胞外 LPS,TNF-α 和 IL-1β 等激活 NF-κB 的同时也使反向调节因子 IL-4,IL-10 及IL-13 释放增多，后者可以抑制 NF-κB 的活化。

　　2 NF-κB 在线粒体凋亡通路中的调节作用

　　线粒体途径是细胞凋亡的一个主要途径。线粒体通透转变孔（ mitochondrial permeability transi-tion pore,MPTP）的开放是导致细胞死亡的主要原因。MPTP 开放后，线粒体跨膜电位降低，细胞色素c（ cytochrome c,Cyt c）等促凋亡活性蛋白释放至胞浆中[11],在 dATP 作用下，Cyt c 与凋亡蛋白酶活化因子 1 （ apoptotic protease activating factor,Apaf-1）形成多聚复合体，启动胱天蛋白酶级联反应，导致细胞凋亡。

　　2.1 抑制凋亡作用

　　NF-κB 在线粒体通路中的抑制凋亡作用可通过对细胞凋亡抑制蛋白（ inhibitor of apoptosis pro-teins,IAP）家族成员 X 连锁 IAP （ X-linked IAP,XIAP） ,c-IAP-1 和 c-IAP-2 等的转录调节来实现[12].XIAP 是 NF-κB 发挥抑制凋亡作用的关键因子，能特异性地结合并抑制凋亡效应因子胱天蛋白酶 3,7 和 9 的活化，进而阻断细胞中 Cyt c 的释放，从而抑制凋亡[13].Wang 等[14]报道，NF-κB 诱导 c-IAP-1,c-IAP-2,TNF 受体 1（ TNF receptor-1,TNFR1）和 TNFR2 基因共同表达，抑制胱天蛋白酶 8活化，阻断 Cyt c 释放从而起到抑制凋亡作用。Yu 等[15]发现，抑制 NF-κB 的活化可下调 c-IAP-1和 c-IAP-2 的表达，从而增强由化疗药物 CPT-11诱导的结肠癌细胞凋亡。

　　另外，NF-κB 的抑制凋亡作用也可通过上调抗凋亡基因的表达实现。Bcl-2 家族蛋白控制着线粒体膜的通透性，在线粒体凋亡途径中起关键作用。Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白（ Bcl-2 和 Bcl-xL）上有 κB结合位点，NF-κB 活化后，线粒体膜上的 Bcl-2 基因和 Bcl-xL 基因表达增加，线粒体膜的通透性降低，阻断了 Cyt c 的释放，从而抑制细胞凋亡[16-17].

　　2.2 促进凋亡作用

　　Shou 等[18]报道，SD 大鼠脑局部缺血时，海马中NF-κB 的激活使 Bcl-2 家族中促凋亡基因（ Bcl-X,Bax）的表达上调，引起凋亡。Tamatani 等[19]研究证实了这一结果，并发现此促凋亡途径可被 IκBα抑制。

　　3 NF-κB 在内质网凋亡通路中的调节作用

　　内质网通路即通过内质网应激（ endoplasmicreticulum stress,ERS）诱导凋亡。细胞受到刺激后，如钙稳态紊乱和氧化应激等，引起内质网中未折叠或折叠错误的蛋白质累积从而引发凋亡。ERS主要通过 CHOP（ C/EBP homologous protein）转录激活、胱天蛋白酶 12 活化和c-Jun氨基端激酶（ c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号活化等 3 条途径启动细胞凋亡。研究表明，NF-κB 与 ERS 介导的 JNK 信号通路有密切联系[20-21].

　　JNK 是 MAPK 家族成员之一，可调控细胞内外不同的应激反应。细胞在应激状态下，需肌醇蛋白酶 1 活化，激活 JNK 进而诱导细胞凋亡。Xia 等[22]在大鼠嗜铬细胞瘤 PC-12 细胞的培养过程中首次发现 JNK 的促凋亡作用。大量研究表明，NF-κB 活化可以抑制 JNK 介导的细胞凋亡。Nakano 等[23]发现，可通过 NF-κB 活化下调细胞内活性氧的水平，从而抑制 JNK 的级联反应信号，达到抑制凋亡的目的。Benedetti 等[24]报道，通过 TNF-α 诱导肾小管近端小管上皮细胞凋亡的过程中，NF-κB 信号转导受到抑制，JNK 信号通路被激活并级联放大，最终导致细胞凋亡。在 TNF-α 介导肝细胞毒性实验中，敲除 IKKβ 基因后，NF-κB 的信号转导受到抑制，JNK 转录水平上调，促进肝细胞的损伤；而在剔除 JNKl 或 JNK2 基因后，JNK 的转录受到抑制，减轻了肝细胞损伤[25].上述研究表明，NF-κB 通过抑制 JNK 信号起到抗凋亡的作用。

　　4 NF-κB 在死亡受体凋亡通路中的调节作用

　　死亡受体途径指胞外的死亡信号通过死亡受体转入胞内诱发细胞凋亡。死亡受体均属 TNFR 基因超家族，其胞外部分富含半胱氨酸的区域有蛋白水解的功能，称为“死亡结构域”,“死亡结构域”使死亡信号得以进一步传递进而启动凋亡。目前已知的死亡受体主要有 Fas （又称 CD95 分子） ,TNFR1,TNFR2,DR3,DR4 和 DR5,前 4 种受体的配体分别为 FasL,TNF,TNF 和 Apo-3L（ DR3L） ,后 2 种均为 Apo-2L,即 TNF 相关凋亡诱导配体（ TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL） ,其中最典型的死亡受体是 Fas 和 TNFR.

　　4.1 抑制凋亡作用

　　细胞内 Fas 与配体 FasL 结合后，启动死亡域并募集 Fas 相关死亡结构域蛋白，形成死亡诱导信号复合物。死亡诱导信号复合物形成后引起胞质内胱天蛋白酶原 8（ procaspase 8）激活，后者自我剪切活化后进一步激活下游的胱天蛋白酶 3 和胱天蛋白酶 7,启动胱天蛋白酶级联反应，引起细胞凋亡。

　　研究表明，激活 NF-κB 可以抑制由 Fas/FasL 信号通路引起的凋亡。Chen 等[26]报道，邻苯二甲酸单乙基己酯通过激活 NF-κB 抑制睾丸支持细胞的凋亡，基因敲除死亡区域相关基因后，募集到 FasL 启动子区域的 NF-κB 数量减少，引起Fas/FasL基因表达增加，促进了睾丸支持细胞的凋亡。Wang等[27]报道，使用 NF-κB 的抑制剂 Bay 11-708,可以增强由 Fas 介导的人白血病细胞（ HL-60）凋亡。另外，Fas 相关死亡域蛋白样IL-1β转化酶抑制蛋白（ Fas-associated death domain protein-like IL-1βconverting enzyme inhibitory protein,FLIP ） ,在Fas 介导的凋亡通路中发挥重要的抗凋亡作用，是由于 FLIP 基因序列上有 κB 结合位点，可上调 FLIP基因表达，抑制胱天蛋白酶级联反应的活化进而抑制凋亡[28].Travert等[29]研究发现，由 TNF-α 或者CD40 配体诱导的 NF-κB 活化可上调 FLIP 的表达水平，从而抑制 Fas,TNFR1 和 TRAIL 介导的凋亡。

　　另外，TNF 是一类重要的效应分子，主要通过TNFR1 和 TNFR2 受体介导发挥生物学效应，这两种受体通过消耗 IκBα 进而激活 NF-κB,活化的NF-κB可上调 TNFR 相关因子（ TNFR-associatedfactors,TRAF）家族成员 TRAF1,TRAF2 及 IAP家族成员 c-IAP-1 和 c-IAP-2 等的表达从而抑制凋亡[30-31].Chang 等[32]发现，通过“发夹”RNA 敲除TRAF2 的蛋白激酶 C 相关激酶 1 相关蛋白后，NF-κB的活性显著降低，TNF-α 诱导的凋亡细胞数量显著增加。

　　4.2 促进凋亡作用

　　Jennewein 等[33]研究发现，由死亡受体介导而引起恶性胶质瘤细胞凋亡的实验中，过表达 IκBα 超级抑制剂（ IκBα-super repressor）使 NF-κB 的活性受到抑制，由 TRAIL 和 Fas 诱导的凋亡细胞数量显著减少。相反，IKKβ 过表达引起 NF-κB 活化，显著增加 TRAIL 介导的凋亡细胞数量。Jayasooriya等[34]报道，在人肝癌细胞 HepG2 凋亡实验中，NF-κB的活化引起 Fas 表达上调，可促进疣孢菌素（ verrucarine） A/TRAIL 介导的细胞凋亡。另外，在对 TRAIL 信号活化途径的研究中，也发现当 p65 过表达时，抑制细胞凋亡，而当 c-Rel 表达增加时，则促进细胞凋亡[35].

　　5 展望

　　NF-κB 是多功能转录因子，有广泛的生物学作用。活化的 NF-κB 在细胞凋亡中有抗凋亡和促凋亡的双重调节作用，但在何种条件下起抗凋亡或促凋亡作用尚不明确。NF-κB 在凋亡中的双向作用可能解释如下： ① 不同种类和不同表达水平的NF-κB亚基与靶基因启动子区域结合，进而选择性影响凋亡过程； ② 细胞中与 NF-κB 同时被激活的其他转录因子，由于代谢状态的不同可影响 NF-κB的最终效应； ③ 细胞种类、细胞生长环境、外界刺激物种类和刺激强度不同，均可导致 NF-κB 的不同效应。研究 NF-κB 在细胞凋亡通路中的调节作用，有助于开发细胞凋亡信号转导途径中相应蛋白分子的激动剂或拮抗剂，在受体水平或受体传递环节上干扰细胞凋亡过程，对凋亡相关疾病的治疗具有重要意义，同时还可为新药开发提供研究思路。

　　参考文献：

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　　[5] Bonizzi G,Karin M. The two NF-kappaB activationpathways and their role in innate and adaptiveimmunity[J]. Trends Immunol,2004,25（ 6） : 280-288.