细胞生物学论文
由于近年来对癌症病人治疗方案（化疗、放疗、骨髓移植）的不断完善，癌症患者长期存活数明显增长，而对于许多年轻的生育期女性存活者来说，经常会出现闭经、不孕及卵巢早衰的临床表现，但是其中许多人都希望建立家庭后可以恢复生育能力，可以拥有属于自己的孩子，因此癌症患者长期存活者恢复生育功能的研究成为近年来研究的热点之一。
癌症患者恢复生育功能有两种方法，其中之一是采取治疗方案前先手术取下一侧或者部分卵巢组织冷冻保存以待长期存活后移植回体内，这样可以生育出有自身遗传背景的孩子。但是对于已经出现卵巢早衰而未预保留自体卵巢的患者来说要想生育出有自身遗传背景的孩子，只能通过某些方法激活自体残存的生殖细胞发育成熟来达到，因此另外一种有效的方法就是骨髓干细胞移植。
骨髓是机体最大的干细胞池，至少包含造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞等干细胞。骨髓干细胞是这些细胞的总称。新研究表明成体干细胞的分化潜能超过了人们预期的想象，如骨髓衍生干细胞可分化为包括中胚层的肌肉、内胚层的肺、肝以及外胚层的脑和皮肤等多种细胞[1].
本文就干细胞向生殖细胞分化进行了初步研究。本研究选择免疫源性低且具有免疫调节功能的雌性 BMSCs 进行双室培养，观察睾丸支持细胞和维甲酸诱导 BMSCs 向卵巢卵母细胞样细胞和卵泡颗粒细胞样细胞分化可能性，哺乳动物卵母细胞和卵泡更新是否存在以及其细胞是否来源于BMSC 及其诱导分化因素提供离体研究的证据，为卵巢早衰的产生机理及治疗提供一种研究思路，也可为由于多种癌症和其他疾病经化疗、放疗结合骨髓移植等方法治愈但生殖功能衰退甚至不育的年轻患者用 BMSC 移植恢复生育功能的研究提供基础。
1 材料和方法。
1.1 方法。
二 步 酶 消 化 和 Tris-HCl 低 渗 法 分 离 12-16d SD 大鼠睾丸支持细胞，全骨髓贴壁法分离青年雌性 SD 大鼠FBMSCs ;用 MTT 比色法检测支持细胞和维甲酸共培养骨髓干细胞的存活及增殖的影响 ;为检测雌性骨髓干细胞分化情况，用 RT-PCR 检测生殖干细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达基因 stra8 mRNA 及卵巢颗粒细胞特异表达基因 fshr mRNA 的表达。
1.2 材料。
1.2.1 仪 器 :CO2细 胞 培 养 箱（MCO-17AC, 日 本SANYO 公司），超净工作台（苏州净化仪器 SW-CJ-IF）普通离心机（Anke TGL-16B），.XSZZ-D2倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）。652- 酶联免疫检测仪（Labsystems,芬兰），紫外分析仪（北京市六一仪器厂），PCR 扩增仪（杭州朗基公司），超速低温离心机 :（Beckman 公司），双室培养系统（transwell insert）（Corning 公司）。
1.2.2 试 剂 :DMEM 细 胞 培 养 液，Tris-HCl 缓 冲 液（20mmol/L），双抗液，四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液，新生牛血清（NBS），胎牛血清（FCS）胶原酶Ⅳ，胰蛋白酶，透明质酸酶（上述三种酶液均用 0.01mol/L PBS 缓冲液配制，使用终浓度分别为 :1）1.0mg/ml ;2）0.8mg/ml ;3）1.0mg/ml），RT-PCR 有关试剂（Trizol,RT-PCR 试剂盒，无核酶水，DL2000（marker），Taq PCR MasterMix 琼脂糖，引物 primer GAPDH :（产物长度为 728bp）。
1.2.3 动物 :10 ~ 12 日龄的健康 Sprague-Dawley（SD）雄 性 乳 鼠， 体 重 15g ~ 19g ;4 ~ 100g 的 健 康 青 年Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠。
1.3 方法。
1.3.1 睾丸支持细胞的分离和培养 颈椎脱臼法处死乳鼠。在无菌条件下切开皮肤，取出睾丸，在冰面上剥除睾丸被膜，剔除周围血管，然后用 PBS 冲洗睾丸实质，将睾丸剪成 1-2mm3的碎块。将碎块置于 2.5mg/ml 的 V 型胶原酶中，在 37℃震荡消化 15-20min,至组织碎块变成索状结构，用 PBS 清洗 3 次，离心（1000r/min,5min）收集细胞，再放入 0.25% 的胰酶中，在 37℃消化 15-20min,用含有10% 新生牛血清的 DMEM 培养液终止消化，离心（1000r/min,5min）收集细胞，重悬后用 200 目不锈钢网过滤，静置 5min,取下层细胞，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 重悬细胞，. 接种 24h 后，吸出培养液，加入低渗 Tris-HCl 2ml/孔，以除去精原细胞，作用 2min 后，加入 PBS 冲洗 2 次，再加入培养应用液重新培养，培养后备用。
1.3.2 雌性大鼠骨髓干细胞的分离和培养 将 SD 雌性大鼠处死，在无菌条件下取出股骨和胫骨。将股骨和胫骨的两端剪开，用 DMEM 培养液（10%FCS,100U 的双抗液）反复冲洗髓腔，以每瓶 1×107接种于培养瓶中，置于培养箱（37℃，5%CO2）中培养，培养 3 天后首次换液，以后隔 2 天换液。培养七天左右，细胞铺满单层后，加入 0.25%胰酶（含 0.02%EDTA）1ml 消化传代，待细胞长至 70% 铺满时再传代培养。
1.3.3 研究睾丸支持细胞对雌性骨髓干细胞存活、增殖中的影响 采用 corning transwell insert 进行共培养，取第二代 BMSCs,以 2×105/ 孔接种至 12 孔板中，分成 2 组，对照组、共培养组接种七块培养板，每天取一个培养板进行用 MTT 法检测细胞生长情况，连续观察七天。采用方差分析对结果进行分析统计。
1.3.4 研究睾丸支持细胞对骨髓干细胞向 stra8+及 FSHR+细胞分化的影响 采用 corning transwell insert 进行共培养，取第二代 BMSCs,以 2×105/ 孔接种至 12 孔板中，分成 2组，对照组、共培养组，以不加药物和无共培养的 BMSCs作为对照，4h 后将接种有睾丸支持细胞的 transwell 小皿与BMSCs 一起共培养 7 天，用 RT-PCR 检测 Stra8、FSHR的表达 :选用 GAPDH 作为内参，所用引物参见实验试剂。理论上推算 RT-PCR 扩增片段长度 :stra8 为 171bp,GAPDH 为 728bp,FSHR 为 498bp.Stra8 PCR 反应参数 :94 ℃ ×5min→ 94 ℃ ×45sec,60℃ ×45sec,72℃ ×45sec,共 35 个 循 环 → 72 ℃ ×5min.FSHR PCR 反 应 参 数 :94 ℃ ×5min→ 94 ℃ ×45sec,62℃ ×45sec,72℃ ×60sec,共 40 个循环→ 72℃ ×5min.各组取 8μl 扩增产物，进行 1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭 5μl/ml），紫外灯下观察结果、拍照，将 stra8 和 FSHR 条带作为骨髓干细胞分化的指标。
采用 SPSS12 软件进行统计学处理，所有定量检测指标均采用 x±s 表示，进行方差齐性检验、单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较用 LSD 法。以 P<0.05 为显着性差异。