细胞生物学论文
2 结果。
2.1 形态学改变。
2.1.1 骨髓间充质干细胞的分离培养BMSCs 的分离采用全骨髓贴壁法。未贴壁前的原代细胞呈圆形，细胞紧密排列，培养 24h 后镜下可见细胞大小不一，形态各异，以多角形、圆形为主（见图 3.5），细胞呈集落式生长。在培养 7d ~ 14d,细胞长满瓶底的70% ~ 80% 后进行传代，传代培养细胞形态逐渐趋于一致，并且出现呈同心圆或漩涡式生长，取第二代细胞接种于放有爬片的 24 孔板中，培养 24h.倒置显微镜下可见细胞形态一致，呈现长梭形为主，低倍镜下可见旋涡状生长，部分区域细胞密集交错呈多层。与支持细胞共培养后，梭形细胞逐渐变圆，培养七天后，大量细胞变成圆形，大小不一（见图 1-4）。
2.2 研究睾丸支持细胞对骨髓干细胞存活、增殖中的影响以 MSCs 单独培养为对照，MSCs 与 SCs、、MSCs 与ATRA 分别进行共培养 7 天，并用 MTT 法检测共培养组和对照组 MSCs 的生长情况（表 1,图 5）。
结果 :培养的第一至第五天，SC 共培养组的 A 值大于 FBMSCs 组（P<0.01），但第六天第七天 SC 共培养组细胞数量显着下降，同 FBMSCSs 组有显着差异（P<0.01）。
ATRA 共培养组第一天、第二天与 FBMSCs 组比较无明显差异（P>0.05）；但在第三天、第四天 ATRA 共培养组的 A值与对照组相比有明显差别（P<0.05）；在第五天，ATRA共培养组与 FBMSCs 组比较无明显差异（P>0.05），但第六天第七天 ATRA 共培养组细胞数量显着下降，同 FBMSCs组有显着差异（P<0.01）。
2.3 研究睾丸支持细胞（SC）和维甲酸对骨髓干细胞向STRA8+和FSHR+细胞分化的影响骨髓干细胞向 STRA8+ 细胞的分化将细胞分成三组SCs 共培养组、ATRA 组、SCs 共培养 +ATRA 组，三组培养条件完全相同，利用 RT-PCR 技术测定各组细胞 STRA8mRNA 的表达情况（实验重复三次），结果见图 6.
在 100bp、250bp 的 marker 电泳条带之间，除单纯MSCs（第二组）各组均可见电泳条带，其片段长度符合STRA8 mRNA 目的片段长度（171bp），而且。分别用各组 STRA8 mRNA 条带的光密度值除以本组内对照β-actin的光密度值发现，SCs 共培养组（第一组）、SCs 共培养+ATRA 组（第二组）、ATRA 组（第三组）分别为 0.6312、0.8425、0.5523,与单纯 MSCs 组（第四组）比较均有统计学意义（P<0.01）。SCs 共培养组、ATRA 组、SCs 共培养 +ATRA 组比较，SCs 共培养 +ATRA 组最亮，SCs 共培养组次之，ATRA 组再次之。两两比较均有统计学意义（P<0.05）
2.3.1 骨髓干细胞向 FSHR+ 细胞的分化将细胞分成三组SCs 共培养组、ATRA 组、SCs 共培养 +ATRA 组，三组培养条件完全相同，利用 RT-PCR 技术测定各组细胞 FHSRmRNA 的表达情况（实验重复三次），结果见图 7.
在 250bp、500bp 的 marker 电泳条带之间，除单纯MSCs 组外各组均可见电泳条带，其片段长度符合 FSHRmRNA 目的片段长度（498bp）。分别用各组 FSHR mRNA条带的光密度值除以本组内对照 β-actin 的光密度值发现，SCs 共培养组、ATRA 组、SCs 共培养 +ATRA 组与第二组单纯MSCs组比较均有统计学意义。SCs共培养组（第三组）、SCs 共培养 +ATRA（第四组）、ATRA 组（第五组）组比较，SCs 共培养 +ATRA 组最亮，SCs 共培养组次之，ATRA 组再次之。两两比较均有统计学意义（P<0.05）。提示 :SCs、ATRA 均可以诱导 FMSCs 分化为 FSHR+细胞，两者共同作用后诱导能力更强，分别作用后诱导能力减弱，推测ATRA 可能为 SCs 分泌的可以诱导 FMSCs 分化为 FSHR+细胞的多种因子之一。
3 讨论。
Stra8（stimulated by retinoic acid gene 8）是哺乳动物生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异性表达的基因。视黄酸（retinoic acid,RA）刺激生殖细胞表达 stra8,只有在表达 stra8 后，生殖细胞才能进入减数分裂的前期[2,3,4].Stra8 在 E12.5（embryonic days,E 胚 龄 ） 到 E16.5 的胚胎卵巢的 XX 生殖细胞上表达[5],在出生后至成年 Stra8在睾丸减数分裂前的精原细胞主要是精原干细胞以及可能包括细线期前的精母细胞上表达，在出生后雌性生殖细胞不再表达，认为 Stra8 是雄性生殖细胞特有表达的基因，Stra8 蛋白在精子发生过程减数分裂前阶段可能起作用[6,7].
Johnson 等研究发现在出生后小鼠卵巢有连续的卵母细胞和卵泡产生[8],在成年雌性哺乳动物的生殖干细胞存在于骨髓，在用化疗药物破坏卵巢的卵母细胞和卵泡池后，可通过骨髓干细胞和外周血干细胞移植引起新的卵母细胞和卵泡产生[9].本研究表明雌性大鼠骨髓干细胞在一定条件下离体培养确实有 Stra8 表达，支持 Johnson 的观点，但即使有骨髓干细胞来源 Stra8 阳性细胞产生的卵母细胞存在，这些细胞是否能进入并完成减数分裂尚需进一步研究。
FSHR 是一种跨膜糖蛋白受体，主要存在于性腺组织中，是 FSH 在体内发挥作用的最主要的介导途径。在雄性动物中，FSHR主要在睾丸支持细胞上表达 ;在雌性动物中，主要分布于颗粒细胞上。对处于动情周期的性成熟大鼠的研究发现，从只有单层颗粒细胞的原始卵泡开始，FSHR 几乎出现在所有的卵泡中，卵子发育过程中，FSHR 的获得被认为是卵泡进一步发育的关键[10].Margret[11]等发现在原始卵泡中即存在 FSHRmRNA 的微弱表达，其表达水平明显低于颗粒细胞表面，且表现为灶性表达，表明 FSHR 参与卵泡发育的整个过程。在卵泡成熟过程中，FSHR 水平随卵泡生长而增加，在卵泡发育的任何阶段，编码胞外区的转录产物明显多于编码胞内区和跨膜区的转录产物。排卵后 FSHR 全长转录产物迅速下降，黄体化后就检测不到，而编码胞外区的转录产物仍然存在，直至黄体中期。随后，Minegishi[12,13]等对人卵巢进行 Northernblot 分析发现人卵巢中存在二种 FSHR 转录产物（4.Ikb 和 2.4kb），FSHRmRNA 在排卵前卵泡中大量存在。
本研究中，我们通过 stra8 和 FSHR 作为指标来检测雌性骨髓干细胞是否可以向雌性生殖样细胞分化。这样有助于判断是否雌鼠骨髓间充质干细胞离体培养条件下能否分化为卵母细胞样细胞和卵巢颗粒细胞样细胞，并且为哺乳动物卵母细胞和卵泡更新是否存在以及其细胞是否来源于BMSC 及其诱导分化因素提供离体研究的证据，进一步为移植后受体鼠产下来源于受体本身生殖细胞后代机理提供离体研究证据，为探讨应用 BMSC 移植恢复不育女性生育功能研究提供基础。
参 考 文 献
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