H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法构建

　　禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科、A型流感病毒属。根据表面糖蛋白血凝素 (hemagglutinin,HA)和 神 经 氨 酸 酶 (neura-minidase,NA)的抗原性差异,AIV可进一步被分为不同的亚型,目前已鉴别出16种HA亚型(H1~H16)和9种NA(N1~N9)亚型。AIV是一种有囊膜、单股负链、分节段的RNA病毒,基因组分为8个节段,分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白。目前,国内外尚未见有H11亚型AIV RT-LAMP检测方法的研究。因此,建立一种快速、简便和特异的检测方法十分迫切,对禽流感的诊断具有重要意义。

　　目前,AIV常用的检测方法包括病毒鸡胚分离鉴定、普通RT-PCR法、实时荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验等。病毒分离鉴定是AIV检测的金标准,先接种鸡胚增殖病毒,再用血凝试验和血凝抑制试验进行鉴定,该法的检测最为常见,但耗时太长,需要2d至1周的时间。普通RT-PCR法和实时荧光定量RT-PCR法快速、灵敏,但仪器相对昂贵,并需技术人员进行操作,不适合在基层推广使用。

　　环介导等温扩增方法(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)是一种新型核酸扩增技术,与其他方法相比,LAMP具有更方便、更简捷、更灵敏和结果可视化等优点,目前在动物病原微生物的检测中被广泛运用。为此,本试验建立了一种H11亚型AIV RT-LAMP可视化检测方法,即利用荧光显色剂钙黄绿素作为指示剂,肉眼观察直接判定扩增结果,使RT-LAMP结果的判定更简单、直 观,为 临 床 快 速 检 测H11亚 型AIV奠 定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer 4.0抽提试剂盒、反转录酶AMV、dNTPs和克隆载体pMD18-T均购自宝生物工程(大连)有限公司。基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

　　Bst DNA聚合酶(大片段)购自New England Biolabs公 司。MgSO4和 甜 菜 碱(Betaine)均购自Sigma公司。

　　1.2 引物的设计与合成根据GenBank中H11亚型AIV HA基因序列,选取H11亚型AIV代表性毒株,筛选保守并能区别其他亚型的HA基因靶序列,使用在线软件Primer Explorer V4设计LAMP引物。引物经NCBI BLAST比对,不与其他亚型AIV和禽病病原体交叉。引物序列见表1。引物由Invitrogen公司合成。
　　
　　1.3 样品的制备H5N3和H7N2RNA均由美国宾夕法尼亚大学惠赠,其他所用毒株信息详见表2。

　　按照MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver.4.0抽提试剂盒的操作说明,提取AIV、新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)的RNA。用基因组DNA提取试剂盒提取传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)DNA。

　　1.4 RT-LAMP反应条件的优化将温度按58、59、60、61、62、63和64℃依次递增,多次重复试验后确定最佳退火温度。按参考文献[10]的报道,对反应体系在如下范围内进行优化:

　　甜菜碱(0.2~1.6mol/L)、MgSO4(1~6mmol/L)、dNTP(0.2~1.6mmol/L)。

　　1.5 特异性和敏感性试验按照优化好的反应条件,对表2中各毒株的RNA进 行RT-LAMP检 测,对ILTV和MG的DNA进行LAMP检测,验证其特异性。按照优化好的反应条件,分别对质量为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg和1fg的H11亚 型AIVRNA样品进行RT-LAMP检测,检验其灵敏度。

　　1.6 临床样品的检测从活禽市场采集206份棉拭子样品,反复挤压、清洗棉拭子,抽提病毒RNA,用H11亚型AIV RT-LAMP进行检测,重复3次,保证试验的准确性。同时,对这206份样品进行抗生素处理后,接种SPF鸡胚分离病毒,验证该RT-LAMP方法的准确性。

　　2 结果

　　2.1 RT-LAMP反应条件的优化通 过 对 反 应 温 度 的 优 化,最 终 确 定 该RT-LAMP检测方法的最佳反应温度为63℃。通过对各反应体系的优化,最终确定RT-LAMP的反应体系为:Bst DNA聚合酶(8U/μL)1.0μL、10×BstBuffer 2.5μL、dNTPs(10mmol/L)3.5μL、甜菜碱(5mol/L)4.0μL、MgSO4(25mmol/L)5.0μL、6条引物预混液(含有浓度分别为40μmol/L FIP和BIP、5μmol/L B3和F3、20μmol/L LF和LB)1.0μL、反转录酶AMV(5U/μL)1.0μL、钙黄绿素(625μmol/L)1.0μL、MnCl2(12.5mmol/L)1.0μL、模板RNA 2μL,以灭菌超纯水补足25μL。充分混匀后,在水浴锅中63℃反应1h,最后80℃作用5min,肉眼直接观察试验结果。

　　2.2 特异性试验用建立的RT-LAMP方法进行检测的结果见表2,只有H11亚型AIV RNA为阳性结果,肉眼观察可见翠绿色和沉淀,而 对其他亚型AIV和常见禽病病原(NDV、IBV、ILTV和MG)的核酸检测均为阴性,肉眼观察可见浅桔色,无混浊,无沉淀,部分毒株的可视化检测结果见图1。
　　
　　2.3 敏感性试验建立的RT-LAMP对H11亚型AIV的最小检测限为10fg(见图2),对质量为10ng~10fg的H11亚型AIV RNA的检测为阳性,肉眼观察可见翠绿色和沉淀,对质量为1fg的H11亚型AIVRNA的检测为阴性,肉眼观察可见浅桔色,无沉淀。
　　
　　2.4 临床样品的检测在活禽市场采集的206份棉拭子样品中,用所建立的H11-RT-LAMP共检测到2份阳性,而病毒分离到2份阳性样品。

　　H11-RT-LAMP检测结果与病毒分离结果一致。

　　3 讨论

　　AIV基因组由8个分节段负链RNA组成。

　　AIV较易发生变异,主要有抗原漂移和抗原转换两种方式。前者主要是由于AIV RNA聚合酶的保真性较低,在病毒复制过程中,HA和NA基因有可能逐步发生核苷酸点突变,不断积累可使表面抗原发生显着变化,产生新的变异株;后者是由于AIV基因组的分节段特性使得两种或两种以上不同亚型流感病毒共同感染一个细胞时,子代病毒在装配时其核酸片段可能以同源交换的形式发生基因重排而导致抗 原 转 变,从 而 产 生 能 引 起 大 流 行 的 新 流 行株。H11亚型AIV最早在1956年从英格兰的鸭体内分离得到。

　　Peng等调查了广西家禽不同HA亚型低致病性禽流感(LPAIVs)的分布和流行情况,发现H11亚型AIV与H3和H6等多种亚型混合感染。赵坤坤等对2009-2010年华东地区家禽LPAIVs进行了流行病学调查,H11亚型AIV的分离率为0.06%,占LPAIVs总阳性样品数的1.72%。彭宜等对2006-2008年华东地区家禽不同HA亚型LPAIVs进行了病原学监测,发现在鸭中分离出比较多的H11亚型AIV,在鸡和鹅都没有分离到。赵坤坤等分离到的1株H11N2AIV可能为多元重组病毒,且可能在高致病性AIV的进化中起了重要作用。因此,加强对H11亚型AIV的监测,建 立 该 型 的 快 速 检 测 方 法,为 掌 握AIV的变异情况提供技术支撑。

　　本研究针对H11亚型AIV HA基因的保守序列,设计了6条LAMP引物,保证了检测的特异性。

　　优化反应条件后,建立了H11亚型AIV RT-LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了检验。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高。由于LAMP反应的扩增效率很高,在少量cDNA存在的条件下就可以进行核酸的大量扩增,所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶,不需单独进行反转录,在63℃等温条件下,一步就可完成RNA的检测,省时且反应效率高。

　　LAMP反应具有较高的灵敏度,反应试剂、反应器材及环境易受到微量核酸模板污染而导致假阳性结果的出现。因此,应把试验分为配液区、模板区和反应区,以免微量的模板污染至反应液中,进而保证检测的准确性。目前,一般LAMP试验反应结束后,需添加荧光染料SYBR Green来观察反应液颜色的变化,极易因打开反应管盖而使反应产物形成气溶胶污染周围环境。因此,本试验在反应前加入钙黄绿素和氯化锰作为荧光指示剂,反应开始之前钙黄绿素与荧光淬灭剂Mn2+结合而不发荧光,反应液为浅桔色。随着反应的进行,产生大量的焦磷酸根离子,而焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素,游离的钙黄绿素就可自发荧光。

　　反应结束后,不需打开反应管,根据肉眼观察颜色,阳性结果为翠绿色,阴性结果仍为浅桔色,实现了RT-LAMP反应结果的可视化观察,同时也避免了打开反应管盖后引起环境污染而造成下次试验的假阳性结果。

　　本研究建立的H11亚型AIV RT-LAMP检测方法特异、灵敏和仪器简单,仅使用一台可控温的水浴锅,1h内即可完成全部反应,并且结果无须任何仪器而仅通过肉眼观察即可判定,一般的实验室均可检测,尤其适合在基层兽医站和养殖场中进行快速检测。总而言之,本研究建立的RT-LAMP方法对H11亚型AIV的有效防控有重要意义,具有较好的应用前景。【图表略】