寄生线虫遗传多样性的分子研究成果探析

　　生物多样性包括遗传多样性、 物种多样性、 生态系统多样性和景观多样性。 在生物多样性这四个层次中， 遗传多样性是核心内容和生物进化的基础。 遗传多样性是指同一物种内不同种群间或同一种群内不同个体间的遗传变异的总和[1], 在 种群间或种群内主要表现为分子、 细胞和个体三个水平上的遗传变异[2]. 通 常来说 , 遗传变异程度的高低是反映遗传多样性大小的最直接表达形式。 在自然界中， 种群是生物进化的基本单位， 种群遗传结构的差异也反映着遗传多样性的程度， 所以遗传变异的大小和种群遗传结构的差异同时决定着一个物种的进化潜力和对不良环境的抵抗能力[3].

　　遗传多样性的研究有着重要的价值， 可以为物种的进化提供理论支持， 加深人们对生物起源的认识， 同时为保护现有资源提供背景资料[4]. 对 于寄生线虫来说， 每年由寄生线虫引起的疾病， 给家畜的健康和畜牧业的发展带来严重的危害， 这使得人们的研究不断深入， 从最初对寄生线虫的形态学、系统分类学和生态学特征等方面的描述， 逐渐发展到遗传特性、 分子进化以及基因功能等方面的研究[ 5].

　　寄生线虫种群遗传学的研究可以在种群间或种群内进行， 遗传多样性依赖于碱基的突变率、 种群的有效大小和种群的迁移率等[6]. 遗传多样性的研究对了解寄生线虫的流行方式、 抗药性等位基因的扩散以及疾病的防控有着重要的意义。

　　1寄生线虫遗传多样性的分子研究方法

　　遗传多样性的研究方法从传统的形态学标记、染色体标记和生化标记逐步发展到DNA分子标记。DNA是遗传物质的载体 , 遗 传信息就是DNA的 碱基排序， 直接对DNA碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性的最理想方法。 与其他标记相比， DNA分子标记不受发育阶段和组织特异性的影响， 多态信息含量丰富， 现已被广泛应用到系统发育、 基因定位和遗传育种等研究中[7]. 此 外 , DNA分 子标记应用于研究种群遗传多样性时， 不需要大量的表型遗传基础作为背景资料， 为加快寄生线虫的分子生物学研究、 诊断分析和潜在疫苗的特征描述提供了技术保障。

　　1.1 限 制 性 片段 长 度 多 态 性 （ restriction fragmentlength polymorphism, RFLP） RFLP 标记是以分子杂交为核心的第1代分子标记技术。 其基本原理是基因组DNA上的特定核苷酸序列可被限制性内切酶识别并切割， 然后与探针结合进行Southern杂交，通过放射显影的方法观察所获得的特异性RFLP图谱[8]. 这 种分子标记的出现 , 使得种群遗传学的发展向前跨越了一大步， 但是同位素标记的使用存在一定的放射性污染， 对于不同发育阶段的个体差异分析， 敏感性不高。随着PCR技术的建立， RFLP常与PCR技术相结合应用于种群遗传多样性的分析中， 既克服了上述方法的局限性， 也省去了酶切和杂交等繁琐的操作过程， 并且仅需少量的DNA模板[9]. PCR-RFLP的原理是将扩增的PCR产物使用特异性的限制性内切酶切割成大小不同的片段， 再利用凝胶电泳分辨其差异性。

　　1.2 随 机 扩 增 多 态 性 DNA （ random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD） RAPD 技 术 最 早 出 现于20世纪90年代， 是以PCR为核心的第2代分子标记技术。 使用该分子标记时不需要了解研究对象的DNA序 列信息 , 利用10个核苷酸的随机寡核苷酸序列作为引物， 对基因组DNA进行PCR扩增， 根据凝胶电泳显示的若干大小不一片段分析该物种的多态性[ 10,11]. 应 用 RAPD 分子标记时所需 DNA 的 量少 ,操作简易， 检测速度快， 可以检测出RFLP标记不能检测的重复序列区， 填补RFLP图谱的空缺， 但是该分子标记重复性和特异性比较差[12].

　　1.3 聚 合 酶 链式反应-单 链构 象 多 态 性 （polymerasechain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP） PCR-SSCP 标 记 是 将 PCR 和 DNA 单 链构象多态性结合的第2代分子标记技术。 其原理是将 扩 增 得 到 的 DNA 双 链 产 物 变 性 处 理 成 单 链 的DNA, 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中 , 根据电泳迁移率的不同， 观察单链DNA构象的差异， 反映出物种的多态性[ 13]. 传 统的 SSCP 分 析采用平板凝胶电泳， 这不仅费时费力， 还不能满足大量筛选突变基因的需要。 有研究者将毛细管电泳与SSCP结合替代了平板凝胶电泳[14], CE-SSCP标 记具有分离效率高、 分析速度快、 样品用量少等特点， 20世纪80年代， CE-SSCP标记得到广泛应用。

　　1.4 扩 增 性 长 度 片段 多 态 性 （ amplified fragmentlength polymorphism, AFLP） AFLP标 记也是第2代分子标记技术的一种， 与RFLP标记不同的是该标记需要两种限制性内切酶切割基因组DNA, 酶切片段的5′端在T4连接酶的作用下与带有两种内切酶黏性末端的接头序列连接， 接头序列是由核心序列和内切酶识别序列两部分组成， 接头序列与引物3′端选择性碱基识别， 对特异性片段进行预扩增和选择性扩增， 在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测PCR产物， 寻找多态性片段[15]. AFLP 标 记兼具了 RFLP和RAPD两种标记的优点， 但是操作比较复杂， 花费较高。

　　1.5 微卫星DNA （microsatellite DNA, SSR） 微 卫星DNA 又 被 称 为 简 单 重 复 序 列 （ simple sequencerepeat, SSR） 或者短串联重复序列 （ short tandemrepeat, STR） , 广泛且随机地分布在真核生物的基因组中[16], 是 由1~6个核苷酸为重复单元组成的串联重复序列。 微卫星DNA呈现出的高度多态性以自身重复单位数的差异为基础， 在DNA复制过程中出现滑链现象， 使重复序列之间发生了插入和缺失等变化， 出现了大量的不同的等位基因从而引起了微卫星DNA的高度多态性[17,18]. 微 卫星DNA 是 由核心序列与其两端的侧翼序列组成的， 根据两端保守的侧翼序列设计PCR反应的引物， 扩增出微卫星片段， 用于遗传多样性的分析。 目前， 微卫星DNA被广泛应用于种群遗传结构分析、 构建遗传图谱、 亲子鉴定和QTL定位等研究中。

　　1.6 线 粒 体DNA （mitochondrial DNA） 寄 生线虫的线粒体基因组与后生动物的线粒体基因组相似，也呈环形， 基因组大小在12~26 kb. 目前大约有110 种线虫的线粒体基因组全部完 成测序和分析 .线粒体基因组包括12~13个编码基因， 分别是烟酰胺脱氢酶亚单位1~6和4L基因、 细胞色素氧化酶亚单位1~3和b基因、 ATP酶亚单位6或8基因 [除旋毛虫 （Trichinella spiralis） 外， 大部分线虫的线粒体基因组不包括ATP酶亚单位8基因], 还包括tRNA基因和rRNA基因[19]. 线粒体基因组独立存在于细胞核外， 与核基因组相比进化速率快， 有母系遗传特征并且能够稳定遗传[20], 常被应用在种群遗传学的研究中， 尤其是相对保守的cox1和nad4基因应用广泛。

　　1.7 DNA 分 子 标 记 方 法特 征 的 比较 DNA 分 子标记可以分为两大类型， I型是与分子标记相关联的基因的功能是已知的， II型是与分子标记相关联的基因功能是未知的[21]. DNA分子标记被广泛应用于种群的遗传学分析中， 每种标记都有自身的优点和局限性， 常用的分子标记特点见表1.

　　2寄生线虫遗传多样性的研究现状

　　2.1 捻 转 血 矛线 虫 （ Haemonchus contortus） 线粒体DNA属于核外基因， 并且具有进化速率快、 母系遗传等优点， 因此常被选作遗传标记应用于捻转血矛线虫遗传多样性的研究中。 国内外均有报道，以线粒体nad4基因作为遗传标记， 对寄生在牛羊体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构进行分析， 包括美国、 希腊、 德国、 瑞典、 澳大利亚、 印度尼西亚、 柬埔寨、 马来西亚、 也门、 巴西、 中国和巴基斯坦等地区[22-27]. 这些研究均表明 , 捻转血矛线虫的遗传变异大部分来自种群内部。 其次， 从全球范围来看， 来自距离相近的国家或同域的种群， 种群间基因流动高， 导致种群间遗传分化程度不高； 而对于不同地理起源的种群来说， 受地理隔离的影响， 种群间基因流动有一定的阻碍， 使得种群间的遗传分化程度相对较高。 而以同样基因作为遗传标记分析寄生在野生动物体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构时， 发现种群内部也表现出较高的遗传变异[28].

　　国外研究者对捻转血矛线虫的微卫星DNA的结构特点也进行了研究， 结果发现捻转血矛线虫的微卫星位点不属于完美型， 但捻转血矛线虫的微卫星标记的多态性比较丰富， 可作为遗传标记用于种群遗传结构分析[29,30]. 利 用8个 微卫星位点分析捻转血矛线虫成虫和3期幼虫的遗传多样性， 结果表明，在对大量的幼虫DNA样品进行遗传学研究以及实验室株和野生株之间的遗传关系分析上， 微卫星标记是一种简便而又快速的手段[31]. 以11个 微卫星位点作为遗传标记， 分析澳大利亚不同气候和地理位置的捻转血矛线虫的种群遗传结构， 结果表明来自澳大利亚不同地理位置的种群表现出明显的遗传差异， 同时也观察到虫体表型上的差异[32].