戊二醛癸甲溴铵溶液的消毒杀菌效果评价

　　伴随着生活水平的不断提高，人们对于食品安全的关注度愈来愈高，已经由传统的数量需求转向质量提高，而规模化、集约化的养殖是确保畜禽产品质量的关键。良好的消毒措施不仅是保护畜禽健康免受疾病困扰的技术保障，而且是显着降低环境病原微生物的关键。因此，规范的消毒措施已成为一种最有效、最便利的预防及控制疾病的手段。

　　高效价优的消毒剂已成为规模化养殖厂的首选。戊二醛癸甲溴铵溶液是我国近年来新推出的一种新型复方消毒剂，它不仅综合了醛类消毒剂和季铵盐的优点，而且二者相互协同，具有双重杀菌效果[1].武守艳等[2]、伍清林[3]等对戊二醛季铵盐复合制剂进行了临床应用研究，但是，有关戊二醛癸甲溴铵溶液在实验室的相关定量和定性杀菌试验等鲜有报道。为评价戊二醛癸甲溴铵溶液的消毒效果，本实验按照国家兽用消毒剂鉴定技术规范（ 试行） 和消毒和灭菌相关标准进行了研究，并同时选择了国外同类产品，以大肠杆菌（ Escherichia coli,E. coli） 和金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus,S. A） 作为杀菌对象，分别进行了定量杀菌试验、定性杀菌试验等，进而探讨该消毒剂的杀菌效果，以期对临床应用提供指导。

　　1 材 料

　　1. 1 试验菌株 大肠杆菌（ CMCC44103） 购于中国兽医药品监察所； 金黄色葡萄球菌（ CMCC26003） 购于中国兽医药品监察所。

　　1. 2 药品

　　1. 2. 1 戊二醛癸甲溴铵溶液 含戊二醛 5% 、癸甲溴铵 5%,以下简称“JM”,由山东省健牧生物药业有限公司研制。

　　1. 2. 2 浓缩型消毒剂 含季铵盐 12. 5% 、戊二醛6. 25% ,以下简称“FG”,由法国某药厂生产。

　　1. 3 试剂 吐温 - 80、甘氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠均为分析纯，试验用水为纯化水，培养基为普通营养琼脂、LB 液体和肉汤培养基。

　　1. 4 仪器 超净化工作台（ LCT - IDC - A） 、电热恒温培养箱（ DHP -420 型） 、立式压力蒸汽灭菌器（ YM50） 、电热鼓风干燥箱（ 101 型） 、电子天平（ YP5102 型） 和电热恒温水浴锅（ XMTD -400 型） .

　　2 方 法

　　2. 1 试验依据 按照国家兽用消毒剂鉴定技术规范（ 试行）[4]和消毒灭菌相关标准[5]进行（ 简称“规范”）。

　　2. 2 试验菌种的制备及活菌计数。

　　2. 2. 1 菌悬液的制备 取第三代大肠杆菌（ E. Co-li. ） 、金黄色葡萄球菌（ S. A. ） 复苏划线接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养 18 ~24 h,挑取单菌落接种于合适的液体培养基，37 ℃摇床培养 24 h.

　　2. 2. 2 活菌计数和稀释 采用 10 倍稀释和平板计数法计数，重复试验 3 次，用 0. 03 mol/L 的 PBS将菌悬液稀释成含菌 107CFU / mL 的试验菌液。

　　2. 3 中和剂筛选实验 参照规范和韩杰[6]方法，选用 3% 吐温 - 80 + 1% 甘氨酸为中和剂，选择浓度适宜的戊二醛癸甲溴铵溶液（ JM） ,以 E. Coli. 和S. A 为受试菌，分别进行中和试验。试验分为 6组，A: 消毒剂 + 菌悬液； B: （ 消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂； C: 中和剂 + 菌悬液； D: （ 消毒剂 + 中和剂） +菌悬液； E: PBS + 菌悬液； F: PBS + 中和剂。结果判定，A 不长菌或长菌数远少于 B,B 长菌数超过 100CFU / mL,C、D、E 组间菌数相差不超过 10% ,F 不长菌，则判定所选中和剂及其浓度适宜。

　　2. 4 定量法

　　2. 4. 1 在规定时间内不同浓度消毒剂的杀菌试验结合预试验结果，将 2 种消毒剂按不同的稀释倍数（ 对 E. Coli: 1∶ 500 ~ 1000; 对 S. A: 1∶ 800 ~1400） 稀释至灭菌的西林瓶中，吸取 0. 5 mL 试验菌液分别加于不同浓度的 4. 5 mL 消毒剂溶液内，置20 ℃ 水浴中作用 5 min,立即吸取上述菌液混合液1. 0 mL,加入 9. 0 mL 中和液混匀； 同时以 0. 03 mol /L PBS 液代替消毒液进行上述各步骤，作为对照组； 中和10 min 后进行平板活菌计数，计算杀菌率。以上实验重复 3 次，每次做2 个平行样，用 t 检验法分析差异显着性。

　　前或对照组活菌数； nt为消毒后或实验组活菌数。

　　2. 4. 2 消毒剂浓度和作用时间对杀菌效果的影响选择 1∶ 700、1∶ 800 和 1∶ 900 三个浓度的消毒液分别对 E. Coli. 进行杀菌； 同时，选择 1 ∶ 900、1∶ 1000、1∶ 1200 稀释的三个浓度分别对 S. A 杀菌。将消毒剂稀释至所需浓度，置西林瓶中，吸取4. 5 mL 加入试管中，20 ℃ 水浴，待试管内液体温度与水浴温度平衡后，在试管中加入 0. 5 mL 菌悬液，混均并开始计时，分别在 5、10、30、60 min,各取0. 5 mL菌液混合液移入 4. 5 mL 中和剂混匀。中和10 min,取 0. 1 mL 三者混合液采用平板法进行活菌计数； 以 0. 03 mol/L 的 PBS 液代替消毒液同步重复上述步骤，作为对照组； 计算杀菌率。以上实验重复3 次，每次做2 个平行样，用 t 检验法分析差异显着性。

　　2. 5 定性法

　　2. 5. 1 消毒剂浓度选择 将灭菌试管 10 支排列于试管架上，标记管号。每个试管加灭菌水 2. 5mL,放（ 20 ± 2） ℃ 水浴中。于第 1 管内加适当浓度消毒液2. 5 mL,混匀后取2. 5 mL 移入第2 管，依次混匀，从第 2 管中取 2. 5 mL 移入第 3 管，以此类推至第9 管，混匀后弃去2. 5 mL,第10 管中不加消毒液作对照。

　　2. 5. 2 消毒剂与细菌作用 将菌液用稀释液配制成含菌量为 5 × 105~ 5 × 106CFU / mL 的菌悬液。

　　以每半分钟加一管的速度加菌悬液 2. 5 mL 于上述各管中，混匀并记录各管加菌时间。各管分别于加菌后 2、5、10、30 min 四个不同间隔时间，取出 0. 5mL,加入 4. 5 mL 中和剂内，中和 10 min 后，取出 0.5 mL 加入 4. 5 mL 营养肉汤管内，37 ℃ 培养 48 h,观察初步结果，无菌生长管继续培养至第 7 天。

　　2. 5. 3 结果判定 若肉汤管混浊，则表示有菌生长，记为阳性，以（ + ） 表示。若培养至第 7 天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性，以（ - ） 表示。无指示菌生长表示达到灭菌。