不同甘草比例的四逆汤生药提取物对胃癌细胞的抑制作用

　　内经曰：“阳气者，若天与日，失其所，则折寿而不彰”。近年来，随着对阳气的日益重视，临床上运用温阳药物治疗恶性肿瘤的报道日益增多，其疗效逐步为大家所认可。于是，出现了用温阳药物治疗恶性肿瘤的实验研究，但多数研究局限在单药或是单药的提取物方面，对于复方治疗的研究颇少。苏州市中医医院肿瘤科主任李湧健教授在长期的临床实践中得出“癌为阴毒，温而化之”的科学假说，并指导他的研究生进行了中医温阳名方四逆汤诱导胃癌细胞凋亡的系列研究，佐证了他的科学假说。在本实验研究中，我们通过 MTT 法观察比较了不同甘草比例的四逆汤生药提取物在抑制胃癌细胞 SGC-7901 中的作用，现报道如下。

　　1、 材 料

　　1.1 细胞株：胃癌细胞 SGC-7901，由苏州大学生命科学院提供。

　　1.2 实验用药

　　1.2.1 5-Fu （浓度 50ug/ml）（生产厂家：上海旭东海普，批号：090916）。

　　1.2.2 中药：制附片（批号：100412）、干姜（批号：100415）、炙甘草（批号：100305）由苏州市春晖堂中药饮片厂提供。

　　1.3 试剂及配制

　　1.3.1 培养基：DMEM（美国 GIBCO 公司）由三蒸水配制，用 HEPES（华义生物工程公司）调节溶液 PH 值至 7.2，过滤除菌，无菌条件下分装，置于 4℃冰箱保存备用，使用时配制成含 10%胎牛血清的完全培养液 [由 90%体积 DMEM，10%体积胎牛血清（杭州四季青公司）及双抗（青霉素 100u/ml+链霉素 100u/ml）配制而成]。

　　1.3.2 PBS：NaCl 8.001g、KCl 0.200g、Na2HPO4*H2O 1.560g、KH2PO40.200g 溶于 1L 三蒸水，经过滤除菌后分装置于 4℃冰箱保存备用。

　　1.3.3 0.25%胰蛋白酶：称取 0.125g 胰蛋白酶（购自上海闪晶分子生物科技有限公司），0.010gEDTA，将两者溶于 50ml PBS 溶液中，经过滤除菌后置于 4℃冰箱保存备用。

　　1.3.4 MTT：称取 12mg MTT 粉末，溶于 24ml 含有 10%胎牛血清的完全培养液中，充分吹打，使 MTT 粉末充分溶解，用 0.22um 微孔滤器过滤除菌备用。

　　1.3.5 二甲基亚砜（DMSO）（购自无锡市展望化工试剂有限公司）。

　　2、 方 法

　　2.1 细胞培养和传代：采用贴壁细胞培养的方法，培养液为含有10%胎牛血清的完全培养液（其中，含有双抗：100u/ml 青霉素,100u/ml 链霉素）。细胞培养环境为 5%CO2，37℃，饱和湿度，2～3d 传代一次。所有实验作用细胞均为对数生长期细胞。

　　2.2 实验分组：实验分为空白对照组、阳性对照组及五个实验组。阳性对照组选用 5-FU，各实验组方用药如表 1 所示（注：表中数字为药量比，四逆汤三药传统配伍比例为 1.5∶1∶1）。

　　2.3 观察指标及方法：MTT：将处于对数生长期的细胞用胰酶常规消化，收集细胞后用含有 10%胎牛血清的完全培养液稀释，调整浓度为 1×105/ml，接种于 96 孔培养板，每孔 100ul。空白对照组中加入含有 10%胎牛血清的完全培养液 100ul/孔，阳性对照组中加入浓度为 50ug/ml 的 5-Fu 100ul/孔，各实验组中分别加入药液 100ul/孔。

　　每组均设 8 个复孔。将 96 孔板放置于 37℃，5%CO2培养箱中培养。

　　24h 后取出，将各孔中的上清液吸出后加入 MTT（0.5mg/ml）溶液100ul，放入培养箱中继续培养 4h 后，用 DMSO 溶液 150ul 终止反应，置于酶标仪 490nm 处测定 OD 值。

　　抑制率（%）=（1-实验组平均 OD 值/空白对照组平均 OD 值）×100%

　　2.4 统计方法：数据以（x±s）表示，采用 Excel 软件中的统计公式计算 x、SD、CV，各药物浓度组与空白对照组的比较、各中药组组间比较均采用 t 检验，以 α=0．05 为检验水准。

　　3、 结 果

　　实验结果显示，经甘草不同配伍比例的四逆汤作用 24h 后，胃癌细胞 SGC-7901 生长受到不同程度的抑制，其中，以实验 E 方对胃癌细胞 SGC-7901 的抑制作用最强，实验 A 方对胃癌细胞 SGC-7901 的抑制作用较弱，结果见表 2。

　　4、 讨 论

　　以上实验中，我们研究了温阳名方四逆汤提取物对胃癌细胞SGC-7901 的体外抑制作用，结果表明，四逆汤提取物对后者具有明显的抑制作用，这个结果进一步佐证了李湧健教授“癌为阴毒，温而化之”的科学假说，为今后进一步研究温阳法治疗肿瘤提供了依据。

　　广西中医药大学刘力红教授在他的著作《思考中医》中提到：“土虽非火，可是却能使火的作用真正落实到实处，使火熟物而不焦物，使火温物而不炎物……四逆汤要想真正地发挥温养的作用、回阳救逆的作用，炙甘草便是关键的关键。”以上各家均认识到了炙甘草在四逆汤中的重要作用。本实验结果亦证明了上述重要作用，提示随着炙甘草在四逆汤中配伍比例的增加，整方对胃癌细胞的抑制作用随之增强，进一步证明了炙甘草对四逆汤整方抗癌作用的影响，启发我们在运用温阳法治疗恶性肿瘤时，应重视甘与温、土与火的配伍关系，为进一步的实验及临床研究提供了实验依据。

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