探讨增压辅助方法对大鼠骨骼肌组织HIF-1α表达的作用

　　低氧预适应是增强机体低氧耐受能力的重要途径，竞技体育进行低氧预适应的主要手段是高原训练。高原训练是在高原低压缺氧环境下利用高压缺氧和运动双重刺激，使运动员产生强烈的应激反应，以调动体内的机能潜力，产生一系列有利于提高运动能力的抗缺氧生理反应。高原训练虽然在实践中取得了一定的成绩但其弊端也不容忽视，这在一定程度上影响了高原的训练质量和其在实践中的应用效果。目前，对高压氧作为运动训练疲劳恢复手段的研究较少，尤其在高原低氧环境下采用高压氧促进疲劳恢复手段方面的基础研究更少。本文探讨增压辅助方法对大鼠骨骼肌组织 HIF-1α 表达的影响，以期快速消除运动疲劳以及有效发挥高原训练优势提供科学依据。

　　1、 研究对象与方法

　　1.1 研究对象

　　健康雄性 2 月龄 Whister 大鼠 32 只，体重为（209.38±10.78）g，由兰州大学医学院（海拔 1520m）实验动物学部提供并供给饲料。实验地点在西宁（海拔2260m），实验室为青海大学医学院动物实验房，自然光照、保持通风；室温 23~25℃、相对湿度 40~60％。实验中大鼠自主饮用净化自来水与进食，饲养室、用具等定期消毒灭菌。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 动物分组

　　大鼠随机分为 4 组（A、B、C、D），每组 8 只。平均体重 A 组（210.25±12.06）g，B 组（208.38±4.75）g；C组（208.00±14.33）g；D 组（210.88±11.99）g。A 组为训练后自然环境下恢复，B 组为训练后进入 0.2MPa 增 压舱内恢复 1h，C 组为训练 后 进 入0.2MPa 增压舱内恢复 2h，D 组为训练后进入 0.3MPa增压舱内恢复 2h。

　　1.2.2 训练方案

　　方案分为适应期和实验期两阶段。其中适应期：大鼠运至海拔 2260m（西宁）后进行 3 天适应训练。

　　实验期：共 6 天，每天进行 1h 的运动性疲劳跑台训练，运动强度的确定参照 Bwdford方法确定大鼠运动强度，两阶段各组的运动负荷安排（见表 1）。实验结束后第 2 天在速度为 35m/mim、坡度为 10°的跑台上运动至力竭。力竭后 A 组自然恢复，B、C、D 组大鼠分别进入增压舱内恢复（见表 2）。休息 24h 后将各组大鼠取样。

　　1.2.3 取材

　　在力竭后恢复 24h 后用 0.4％戊巴比妥钠 1ml/100g体重麻醉后，仰卧位固定于手术台上切取腓肠肌。滤纸吸水后，放入离心管中置于液氮冷冻，存放于 -80℃冰箱保存待用。

　　1.2.4 指标测定

　　传统裂解液裂解法提取蛋白。蛋白浓度测定严格按 BCA 蛋白试剂盒说明书操作。提取的腓肠肌蛋白40ug 样本用 12%的聚丙烯酰胺凝胶进行 SDS-PAGE电泳（120V1.5h），取下层胶进行半干电转至 PVDF 膜上。用含有 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液室温下封闭 2h，加入一航（HTF-1 1∶1000，GAPDH 1∶3000）4℃孵育过夜，二抗常温孵育 1h，TBST 充分洗膜 10 次，6min/次，洗膜后使用 EOL 试剂对胶片暴光显影与定影。采用所测目的蛋白条带与内参 GAPDH 条带的比值表示目的蛋白的表达水平。

　　1.2.5 试剂与仪器

　　兔抗 HIF-1 单克隆抗体（Abcam 有限公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG（碧云天生物科技有限公司）、BCA 试剂盒（美国 Pierce）、兔抗GAPDH（Gen Tex 美国）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（碧云天生物科技有限公司）、蛋白标准分子量 maker（购于上海前尘生物科技有限公司）、增压氧舱（WEIGAOSC350/0.2-400 型 山东威高集团医用分子制品有限公司）、跑台（DSPT-202 中国杭州段氏）、酶标仪（美国 ELX800）、电泳仪（美国 Power PacHc）、半干转膜仪（美国 BIO-RAD）。

　　1.2.6 数理统计法

　　实验所得数据使用 Excel 软件进行整理、分析。

　　2、 结果

　　第 7 天增压干预后 24h，采用 wster biot 检测各恢复组大鼠骨骼肌 HIF-1α 蛋白表达较自然恢复组呈上升趋势，其中 0.2MPa 增压 1h，恢复组 B 组增幅较大（见图 1）。

　　3、 分析与讨论

　　哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反映的转录因子，能激活许多低氧反应性基因的表达，是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质,称低氧诱导因子。低氧诱导因子 -1（Hypoxia inducible factor，HIF-1）在 1992 年被首次发现它由 α 和 β 亚基构成异二聚体，在低氧条件下组织细胞产生的一种核蛋白，用于维持氧稳态的关键性物质。HIF-1α 的蛋白表达水平受氧因素、过渡金属、一氧化氮等因素的影响，其中主要受氧分压调节。

　　有研究表明，HBO 能明显促进脑出血大鼠脑内HIF-1α 的表达，从而促进 VEGF 的表达，加快血肿的吸收，促进微血管新生和神经功能的恢复。杜晶在高压氧耐受机制的初步研究中发现，高压氧反复暴露使大鼠脑内 HIF-1α 含量增加。丁建波在高压氧对大鼠胶质瘤生长的实验研究中发现 HBO 可上调大鼠胶质瘤内 HIF-1α、VEGF 因子表达，使肿瘤内部微血管形成增多，抑制瘤内及瘤周细胞凋亡。这些研究表明HBO 暴露可使 HIF-1α 表达上升。

　　实验第 7 天增压干预后 24h 应用 western blot 检测大鼠骨骼肌中 HIF-1α 蛋白，各恢复组大鼠骨骼肌HIF-1α 蛋白表达较自然恢复组呈上升趋势，其中0.2MPa（绝对压力）增压 1h 恢复组（B）增幅较大。本实验结果与 HBO 暴露的相一致，增压干预恢复组大鼠骨骼肌 HIF-1α 蛋白表达上调可诱导其下游的靶基因转录增加，促进大鼠骨骼肌的疲劳恢复。

　　本研究是通过利用增压氧舱压缩空气，提高机体血氧分压和血氧含量，使组织内氧含量和储氧量相应增加，从而改善机体缺氧的状态，利于机体的疲劳恢复。HIF-1 是介导细胞适应低氧状况的核转录因子，在正常细胞内含量很少，有研究表明 HIF-1α 蛋白的表达及活性调节受很多因素的影响，其中氧是最关键的因素，其在常氧下极不稳定，有很短的半衰期（<5min），常氧下 PVHL 与 HIF-1α 相互作用，经 PVHL 调节的泛素蛋白酶体路径迅速降解。本实验应用 western blot检测大鼠骨骼肌中 HIF-1α 蛋白，施加增压辅助方法干预后的各恢复组大鼠骨骼肌 HIF-1α 蛋白表达较自然恢复组呈上升趋势，其中 B 组增幅较大，见图 1。

　　从常识与表象上理解高压氧（Hyperbaric oxygen，HBO）和低氧对机体的影响是相悖的，前者使体内氧和二氧化碳含量升高，后者使体内氧和二氧化碳含量降低。实际上，HBO 和低氧对机体的影响也有相似之处。如两者都会对机体产生损伤甚至导致个体的死亡。同时两者的适应性暴露也会增强机体的抗氧化损伤，减轻中枢神经系统的缺血性损伤。上述现象提示 HBO 适应性暴露可能会增强机体的低氧耐受能力，成为低氧预适应的替代方案。

　　HIF-1 是低氧耐受过程中最重要的转录因子，但HIF-1 本身并不直接发挥增强机体低氧耐受能力的生物学效应，而是通过激活多种低氧耐受相关基因的表达，使这些基因的蛋白产物增加，发挥多种具体的生物学效应。血管内皮生长因子（VEGF）是低氧敏感型基因，HIF-1 诱导 VEGF 转录，引起组织毛细血管增生，可以改善心脏和骨骼肌自身的氧和营养物质供应，对机体有氧运动能力的提高极为有利。在低氧运动训练中，由于缺氧和能量的大量消耗及血液的重新分配，使机体的部分组织和细胞处于一种相对缺血和缺氧的状态，从而促使 HIF-1 的表达增加，它的表达增强能活化 VGEF 基因的转录和增强 VGEFmRNA 的稳定性，上调其基因的表达而促进血管的新生，更有利于组织氧和营养成分的供给，增强机体的体能。本研究显示，增压恢复组大鼠 VEGF 较自然恢复组高，且两组有显著性差异。杜晶在高压氧诱导机体低氧耐受机制的初步研究中发现，高压氧反复暴露使大鼠脑内 HIF-1α含量增加。有研究表明，HBO 能明显促进脑出血大鼠脑内 HIF-1α 的表达,从而促进 VEGF 的表达,加快血肿的吸收, 促进微血管新生和神经功能的恢复。

　　Gustafsson 等的研究表明，非限制血流的动力练习可使骨骼肌 VEGFmRNA 表达增加 111％，而限制血流的动力练习可使骨骼肌 VEGFmRNA 表达增加 236％，两种情况下 VEGFmRNA 虽无显著不同，但后者增加的趋势较前者明显 ， 并 且 VEGFmRNA 的增加与HIF-1mRNA的增加呈正相关。郑澜等证明，VEGFmRNA与 HIF-1mRNA 的相关系数为 0.93，说明低氧和运动骨骼肌组织中 HIF-1 蛋白表达的增加对 VEGF 基因转录具有促进作用。丁建波在高压氧对大鼠胶质瘤生长的实验研究中发现 HBO 可上调大鼠胶质瘤内HIF-1α、VEGF 因子表达，使肿瘤内部微血管形成增多,抑制瘤内及瘤周细胞凋亡。这些都表明 HBO 可能对增强机体低氧耐受能力产生影响。本研究通过 1 周高原低氧环境下大强度运动后施加增压辅助方法恢复的实验发现，增压辅助方法干预的恢复组大鼠骨骼肌HIF-1α 蛋白表达上调，验证了高压氧反复暴露可使HIF-1α 表达上升的结论。

　　综上所述高原训练大强度训练后施加增压辅助方法可增强机体的低氧耐受能力，有利于机体运动疲劳的快速恢复以及有效发挥高原训练优势。

　　4、 小结

　　通过 1 周低氧大强度训练后，施加增压辅助方法的实验发现经增压辅助方法干预后各恢复组大鼠骨骼肌 HIF-1α 蛋白表达上调，表明高原训练后施加增压辅助方法可能对增强机体低氧耐受能力产生影响，有利于机体运动疲劳的快速恢复及有效发挥高原训练的优势。

　　参考文献：
　　[1] 马福海，冯连世.高原训练实用问答[M].北京：人民体育出版社，2007.