水稻育种中基因编辑技术的应用

　　基因编辑论文（专业热点范文8篇）之第三篇

　　摘要：水稻是世界上超过四分之一人口的主粮，又是模式植物，近年来CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中出现了爆发式的增长，为此我们重点关注了CRISPR/Cas9系统在这一领域中的应用。本文同时阐述了CRISPR/Cas9在基因组编辑领域的问题和其他应用方面的困难，探讨了基因编辑工具在作物改良方面的所面临的主要挑战和未来发展趋势。

　　关键词：CRISPR/Cas9,基因编辑,水稻育种,应用

　　在二十世纪中叶，Muller和Auerbach证明了通过辐射或化学处理可以提高诱变率。但是这些操作，如辐射和化学诱变，在基因组中产生的是随机变化的位点。在20世纪70年代和80年代，在酵母和小鼠产生了第一批靶向基因组变化。从本质上来讲，基因组编辑所做的就打断染色体DNA，而其关键在于这种打断是有特异性的，是针对特定位点的。DNA双链断裂(DSB)发生后，细胞会采用DNA修复机制对断裂点进行修复，修复过程中，目的基因会发生特定类型的突变或插入，从而实现基因编辑。通常，修复机制导致非同源末端连接(NHEJ)和同源定向重组(HDR)两种类型的修复。NHEJ主要导致可变长度的插入和缺失突变(Indel)，因此可用于敲除基因。HDR通常依赖于未损伤的染色单体中与同源序列的重组，HDR基因打靶在高等真核生物细胞中不是一个有效的过程，通常只有大约一百万个处理过的细胞中有一个经历了所需的基因组修饰。这种基因编辑有着非常大的潜力，但是由于目前技术条件下，其非重组效率非常低，且还受其他相关技术的限制，因而其应用范围还比较有限。

　　1 CRISPR/Cas9技术

　　在TALEN技术问世后约两年，另一种基于CRISPR/Cas的基因组编辑系统被开发了出来，其主要元件是非编码RNA和Cas蛋白。与嵌合TALEN蛋白不同，CRISPR/Cas系统的通过非编码RNA识别靶位点，利用RNA和DNA之间互作来进行靶基因的锚定，形成的非编码RNA和Cas蛋白的复合物则会切割相应的基因位点。早在1987年，人们就在某些细菌基因中就发现了一些奇特的重复序列，而在接下来的近20年里，它们的功能一直没有被搞清楚。直到2005年，细菌基因组的测序才逐渐揭开了这些序列的神秘面纱。相关的研究显示许多微生物的基因组中的都存在相似核苷酸序列，即一些通过短回文重复序列分开的DNA的区域。由于此功能，它们被命名为CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)。此外，这些CRISPR表达盒往往位于具有解旋酶和核酸酶活性的Cas基因附近。2005年，三个独立的生物信息学研究小组报告，CRISPR表达盒中间区DNA通常与许多噬菌体和质粒的DNA同源。2007年，在嗜热链球菌中的研究表明，细胞如果在CRISPR基因座上携带与噬菌体基因组DNA互补片段，会使其对噬菌体具有抗性。

　　2 基因编辑的应用

　　2.1 基因编辑在农业方面的应用情况

　　CRISPR/Cas9是目前获得了广泛认可专一性好，基因定点突变效率高的基因组编辑技术。作为新的基因定点编辑工具，其构建简单、成本低、快速且高效，已广泛应用于牲畜和农作物的基因组编辑。从本质上讲由基因编辑所产生的新品种，都是经过了基因改造的，属于广义的转基因范畴。但它们与早期的转基因生物又有着重大的差别。大多数情况下，这些新品种没有引入来自其他物种的遗传物质，而且由引入的变化通常在自然情况下也会发生。即使是在利用基因编辑导入外源的DNA导入时，它们也是被精确的插入到基因组上特定位置。因此，相比传统的转基因技术，它的安全性要高得多。

　　目前基因编辑作物的例子非常的多，包括高产的水稻抗病的小麦，耐储存的马铃薯和生产健康油料的大豆等。畜牧产品方面，也已经有很多成功案例，如缺乏角的奶牛，绵羊，携带更多肌肉的猪和其他食用动物。基因组编辑具有优于育种选择的优势，即可以在一代中引入性状而不破坏有利的遗传背景。可以将相同的有益修饰引入适合于不同环境的不同品种或栽培品种。2016年，Nature杂志在报道中提到美国宾夕法尼亚州立大学科学家杨亦农利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的工程化蘑菇已经开始种植并且售卖，而美国农业部(US Department of Agriculture)并没有对这种新型的CRISPR/Cas9基因编辑蘑菇进行管制。美国农业部认为这种新型蘑菇并不需特殊的监管程序来监管这种蘑菇的培养和售卖。除了上述的蘑菇避开了美国农业部监管系统的，其他还有几十种转基因生物(Genetically Modified Organisms,GMOs)(大多数是植物)也被美国农业部认可无需特殊的监管。而这些通过编辑进行精确基因组修饰的产品是否会比早期的转基因生物更容易获得公众认可，还值有待观察。

　　2.2 CRISPR/Cas9技术在水稻中育种中的应用前景

　　全球有超过30亿人每天摄取大米，水稻(O-ryzasativa L.)所提供的能量大约占世界膳食消耗总能量的20%。由于水稻具有广泛的适应性，因此，它的生产是事关全球粮食安全的战略性议题。随着基因编辑技术的快速发展，CRISPR/Cas9技术在水稻基因功能研究方面有了长足的发展。采用CRISPR/Cas9技术编辑水稻基因组，改变水稻各种农艺性状，已不再具有不可逾越的技术障碍。在过去的几十年中，传统的突变体筛选和分子辅助育种为水稻生产做出了巨大贡献。然而目前，水稻生产面临着诸多的新挑战，如人口快速增长，全球气候变化，以及由此衍生的新的病虫害及其他环境问题。因此，迫切需要更先进的技术和方法，来创制水稻新品种，使其具有更高的产量，更好的生物/非生物胁迫耐受性。

　　从2013年起，有大量关于CRISPR/Cas9系统在水稻中成功定向诱变的报道。其中部分研究还显示，相比于TALEN,CRISPR/Cas9系统诱发的突变频率更高。在作物中，产量、质量和胁迫响应等其农艺学性状往往由多个基因组位点共同控制，因此有不少研究开始探究水稻多靶点基因编辑的方法及效率。实际的结果也非常的鼓舞人心，基于CRISPR/Cas9构建的三靶点、四靶点的基因编辑都获得了成功。这些研究清楚的表明CRISPR/Cas9系统是水稻染色体工程的高效工具。MaX.等2015年的研究还测试了基因组编辑的效率。在水稻基因组中编辑的46个目标位点，平均突变频率为85.4%。该研究还同时编辑了OsWaxy基因内的三个位点，使编辑后的材料直链淀粉含量降低了14%。此后，梁等人在2016年开发了水稻CRISPR/Cas9-sgRNA多重编辑系统的新策略，设计了21个sgR-NA，其中82%的目标位点显示缺失，插入，取代和倒位，从中我们也可以明显看出CRISPR/Cas9优秀的编辑效率。所有这些报告清楚地表明，CRISPR/Cas9系统能够高效地产生单个或多个基因突变，可用于加速水稻育种。

　　近年来，运用CRISPR/Cas9技术在水稻创制的水稻新材料如雨后春笋般涌现。这一技术为我们从基础研究到生产应用的衔接提供了桥梁，能为水稻育种实践提供更直接的助力，有着及其广阔的应用前景。更重要的是，CRISPR/Cas9技术在水稻中的应用具有很强的实用性。例如，针对水稻抗病性的研究和产量方面的研究。水稻对东格鲁病抗性与翻译起始因子4γ基因(eIF4G)密切相关，利用CRISPR/Cas9产生突变后，敏感品种IR64，也能够获得对东格鲁病抗性，从而增加水稻的产量。关于水稻产量方面，此前的研显示采用CRISPR/Cas9系统同时对Grain Width2(GS3)、Grain Width(GW5)和Grain Width(TGW6)的编辑，能够导致谷粒重量显着增加。而朱健康院士团队，最近又成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术来编辑ABA受体基因，从而提高了水稻产量。

　　3 基因编辑的优势及面临的问题

　　常规转基因技术普遍采用的方式是通过导入外源基因来实现相关性状的改良。这种操作会向作物基因组导入三类外源物质。一是目标外源基因，二是用于调控目标基因表达的相关元件；三是转基因筛选标签。其中，外源基因又可以从亲缘关系上分为多种情况。例如，向水稻导入不同品种的基因，导入同族的野生稻基因，导入其他物种基因等等。而表达调控元件和转基因筛选标签更是五花八门，各种各样。正是由于这种纷繁复杂的情况，导致了转基因产品管理的复杂性。也导致社会和科学共同体内部都对转基因应用的安全性存有挥之不去的疑虑。这些担心也是很好理解的，因为任何一部分外源物质导致的不可预知后果，都会影响到转基因产品整体的安全性。这些担忧导致也是农业转基因生物技术应用的主要阻力之一。

　　以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术，与传统的转基因技术有着很大的差别。从本质上来讲，它们的生物学功能是切割降解DNA，因此，CRISPR/Cas9基因编辑技术非常适合于对特定目标基因的特定位点进行剪切，造成单核苷酸级别的改变，从而改变作物原有基因功能。当然，CRISPR/Cas9或其他方法介导的双链断裂后的DNA修复过程则都取决于细胞的修复机制。NHEJ在连接断裂DNA时会引入一些突变，而大多情况下高等真核生物NHEJ产生突变，而非插入DNA片段。因此，如果目标仅仅是敲除蛋白质编码序列，这样的编辑效率是比较高的。当然这个技术也能用于外源DNA片段导入，只是效率比较低，成本比较高。值得一提的是对于非插入型的应用来讲，在基因编辑完成后，我们可以从分离的后代中找到完全没有任何外源片段的材料，这也是大家追求的结果。就目前的报道来看，包括CRISPR/Cas系统和ZFN、TALEN在内的基因编辑方法均具有较好的有效性，但它们的特异性都不完美，均存在脱靶问题，而且有潜在的可能产生一系列脱靶效应，引起基因组的重排或者无法预测的突变，甚至会导致细胞的死亡。而人们对脱靶的关注程度取决于应用。在医学应用上，这个问题相对严重，因为脱靶导致的无法预测的结果有时是无法接受的。当然如果脱靶不会导致引发新的临床病症的突变，它们并非不可忍受。在农业应用，尤其是作物基因编辑方面，由于不涉及伦理问题，这个缺点就不是非常明显。因为研究人员可以对作物的基因组进行完整的测序，并且可以彻底分析突变材料的表型，从而排除那些无效或有害的突变。

　　展望

　　随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的飞速发展，人们变得越来越关注这一技术的伦理和社会影响。在医学领域，如何限定基因编辑技术的应用显得非常令人困惑。当然，针对有些破坏性疾病，例如亨廷顿病和肌肉萎缩症这样病症，显然社会会比较容易形成共识。但是如果是身材矮小、运动能力低下这些问题，显然回答就会模糊得多。更进一步，头发颜色，眼睛颜色，身高，肤色，这些方面是能允许作出人为的改变，这种涉及更深层次的伦理问题操作一定会引起更广泛争论。所幸的是在农业应用方面，这些问题不那么尖锐，因为农业产品尤其是作物往往很少涉及伦理问题。但监管方面的争论仍然十分的激烈。目前欧盟对转基因和基因编辑的监管在全球来讲相对比较严格。其法律要求任何基因改造的作物都必须是可检测的，且遗传变化必须与传统育种技术具有相同的稳定性。但欧盟内反对转基因群体的呼声一直也很高，这些群体认为转基因技术有可能产生“非自然”的危害，因为它们不是生物体的“正常”部分，基因编辑同传统的转基因一样应该受到严格的监管。但是像CRISPR/Cas9，这样的新技术又显得非常不同，因为所有的基因编辑变化虽然都是可检测的，但这些改变与其他传统的育种方法，如辐照诱变，化学诱变引入的变化无法区分。因此，在目前争论还在继续的情形下，政府与国家层面的规范和立法对技术未来的发展显得至关重要。