PRV基因工程疫苗中基因重组技术的应用

　　摘    要：　猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的急性高度接触性传染病，可造成不同日龄的猪发病，给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因进行改造，敲除毒力基因或插入免疫增强基因，是降低PRV毒力或提高病毒免疫保护效果的有效方法之一，也是研制安全高效PRV基因工程疫苗的重要手段。从基因同源重组、Cre/lox P位点特异性重组、细菌人工染色体和CRISPR基因编辑等不同基因重组技术应用方面对猪PRV基因工程疫苗的研制进行综述，为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。

　　关键词 :     伪狂犬病毒;基因工程疫苗;基因编辑;同源重组;位点特异; CRISPR;

　　Abstract：　Porcine pseudorabies is an acute and highly contagious disease caused by pseudorabies virus infection, which can cause disease in pigs of different ages and serious economic losses to the pig industry. One of the main measures to prevent, control and even eradicate porcine pseudorabies is vaccination. It is one of the effective methods to reduce the virulence of PRV or improve the immune protection effect of virus by transforming the key virulence genes of PRV, knocking out the virulence genes or inserting the immune enhancement genes through gene recombination technology, and it is also an important means to develop a safe and efficient genetic engineering vaccine of PRV. The development of pig PRV genetic engineering vaccine was reviewed from the application of different gene recombination technologies, such as homologous recombination, Cre/loxP site-specific recombination, bacterial artificial chromosome and CRISPR gene editing, with a view to provide references for further study of PRV recombinant vaccine.

　　Keyword：　pseudorabies virus; genetic engineering vaccine; gene editing; homologous recombination; site-specific; CRISPR;

　　伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）为疱疹病毒家族成员，猪是PRV的天然宿主和主要传染源[1]。PRV感染能够引起母猪流产、产死胎，仔猪出现神经症状，成年出现猪呼吸困难等系统性疾病，对世界各地养猪业造成巨大经济损失。1970年开始，我国生猪饲养规模化发展，但国外种猪大量引进和国内生猪频繁调运等因素使PRV在我国呈蔓延趋势，严重影响我国集约化生猪养殖产业的健康发展，直至引入匈牙利Bartha-K61株疫苗后，通过免疫接种、野毒监测及净化等技术手段,才有效控制了猪伪狂犬病疫情[2]。但使用该疫苗会出现潜伏带毒和毒力返强的可能。2011年开始，许多规模化猪场都不同程度地出现了传统疫苗免疫失败的情况，猪发病率和死亡率明显上升，并出现了新的发病特征。近几年，我国很多地区都从病猪中分离出了新的PRV毒株，并且证实为PRV变异株。将PRV变异株与传统PRV毒株进行相关毒力基因序列对比，发现两者之间存在明显差异，新的PRV毒株抗原性已发生一定变异，传统的PRV毒株属于基因Ⅰ型,而变异株属于基因Ⅱ型。与经典强毒株相比,PRV变异株引发的的临床症状更明显，传播速度更快，死亡率更高,呈现出毒力增强的趋势，Bartha-K61疫苗已不能提供完全保护，导致我国呈现PRV变异株大面积流行的情况[3,4,5]。
 

　　PRV毒力由多基因共同调控,病毒的复制和致病机制复杂，且毒力增强机制尚未研究清楚[6]。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因敲除或插入免疫增强基因，是降低病毒毒力或提高病毒免疫原性的有效方法之一，也是研制PRV基因工程疫苗的重要手段。自20世纪80年代基因重组技术出现后，已有多种技术手段应用于PRV基因组的改造，根据其原理的不同，大致可分为四类：经典的基因同源重组技术、Cre/lox P位点特异性重组技术、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）技术、CRISPR基因编辑（Genome-editing）技术。本文综述了目前应用于PRV的基因重组技术，以期为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。

　　1、 PRV基因组

　　1.1、 PRV基因组结构

　　PRV是一种双链DNA病毒，其基因组庞大，约为150 kb，GC含量高达74%，至少含有70多个开放阅读框（ORF），编码100多种病毒蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白质。PRV病毒基因组由长独特区段（Unique long，UL）、短独特区段（Unique short，US）及US两侧的末端重复区（Terminal repeat sequence，TRS）与内部重复区段（Internal repeat sequence，IRS）组成。由于UL区与US区方向可以相同或相反，因此PRV有两种异构体，且两种异构体均具有感染力。

　　1.2 、PRV基因功能

　　目前已基本研究清楚PRV基因组中70多个基因的功能，主要是用于编码病毒的结构蛋白、免疫调节蛋白、转录调节因子、毒力相关蛋白、病毒复制与释放相关酶类等。PRV一共有11种糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN），其中gG为非结构成分，是与分泌相关的蛋白，其余10种均为结构蛋白，在病毒感染机理、复制机制和免疫诱导中具有特殊作用[7]。gB、gD、gH、gL、gK是病毒复制所必需的糖蛋白，gE、gI是病毒的主要毒力基因。在免疫诱导方面，糖蛋白gB、gC、gD是PRV的主要保护性抗原蛋白。此外，胸苷激酶（TK）、核酸还原酶（RR)、蛋白激酶（PK）、碱性核酸外切酶（AN）和脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）等与PRV的毒力密切相关，其中TK基因编码胸苷激酶，是PRV最主要的毒力基因，也是决定PRV持续感染的重要因素。TK基因缺失后，病毒的毒力将明显降低[8]。相关研究[9]发现，PRV超过一半是复制非必需基因，这些基因通常也是毒力相关基因。缺失毒力相关基因会降低PRV的毒力但不影响病毒生长，由此PRV可作为一种异源基因插入的理想载体。

　　2 、PRV基因工程疫苗的基因重组技术

　　2.1 、基因同源重组技术

　　同源重组（Homologous recombination, HR）主要是基因同源序列发生在分子间或分子内的DNA，交换对等部分然后重新组合。根据同源重组原理，合理设计并通过目的基因克隆、融合PCR和酶切连接等方法构建不同结构的重组载体，然后利用DNA转化技术将其导入宿主细胞中，实现对宿主基因序列的插入、缺失或者置换突变。通过体外同源重组技术构建重组病毒，筛选一个亲本毒株复制非必需基因片段，将此片段克隆到质粒转移载体上，再与病毒基因组DNA共转染到细胞进行同源重组，最终将外源基因导入病毒基因组。重组病毒具有与亲本株相同的生物学特性。但是在重组病毒研究中应用，同源重组技术与反向遗传操作技术（病毒拯救），RNA干扰和PCR修饰等有所不同，这种方法避免了在体外直接操纵基因，不需引入其他DNA序列，并且简化了实验程序。同源重组有磷酸钙-DNA共沉淀转染法、脂质体介导的DNA转染法、含质粒DNA的细胞原生质体与哺乳动物细胞融合技术等3种方法[10]。同源重组技术改造病毒，其重组效率不高，重组病毒纯化筛选过程也相对较复杂。

　　目前，人们已经利用同源重组成功构建了多种重组病毒。王琴等[10]领先开展了系统性PRV分子生物学研究，采用磷酸钙法和脂质体介导的DNA转染法将TK缺失重组质粒PDTK-DNA与PRV Fa DNA进行同源重组，获得了PRV Fa TK－毒株。该团队用磷酸钙转染了构建的PP63LacZ转移载体质粒和PRV Fa DNA到MDBK细胞，通过同源重组获得了PRV Fa gE－/gI－/LacZ基因缺失株。将pDTK 3-6、5-6 TK缺失质粒与上述双基因缺失菌株在TK-143细胞中同源重组以获得gE－/gI－/TK－三基因缺失疫苗株（PRV-SA215株）[11]。陈焕春等[12]将PRV鄂A株TK－突变株基因组DNA和TK缺失转移质粒pUCPB采用磷酸钙法共转染PK-15细胞，构建了PRV Fa TK基因缺失株。WANG等[13]构建了PRV AH02LA株的感染性克隆，获得了gE缺失突变株PRV(LA-AB)，将PRV(LA-AB)株灭活后加入佐剂制备灭活疫苗，显着减少了攻毒后病毒脱落，能为动物提供完全的临床保护。童武等[14]采用同源重组的方法对PRV变异株（JS-2012株）进行改造，成功构建了PRV gE和gI双基因缺失的病毒株（JS-2012-ΔgE/gI株），以PRV-JS-2012-ΔgE/gI毒株为种毒，开发出了PR活疫苗和灭活疫苗，经过免疫学试验，结果表明该活疫苗与灭活疫苗对两周龄哺乳仔猪具有安全性，免疫后仔猪得到充分的免疫保护，能抵抗经典PRV或PRV变异株，其免疫原性和反应原性表现优越。

　　2.2、 Cre/lox P位点特异性重组技术

　　Cre/lox P位点特异性重组系统来自于大肠杆菌噬菌体P1，该系统由特异性Cre重组酶和特异性lox P位点两部分组成。Cre重组酶能够识别特异的DNA序列（lox P位点）并进行特定的切割和拼接。Cre重组酶蛋白有N端和C端两个结构域，N端与lox P的识别有关，C端处有1个四联体结构，是Cre基因的活性中心，与DNA的切割结合都有关。Cre酶的特异识别位点lox P是两个13 bp的反向重复序列与8 bp的间隔序列。位点特异性重组发生在特定DNA序列之间，在重组酶的介导下，识别并切割特定DNA序列，实现结合交换，完成重组[15,16]。位点特异性重组只发生在特异位点之间，克服了外源基因随机整合带来的不确定性，有助于推动构建稳定、高效的基因表达系。

　　王敏秀[17]将Cre/lox P系统应用于PRV重组，将单个的lox P位点插入到TK-PRV SH株中，构建了PRV上海株TK基因缺失株（rPRV2），其含有单个lox P位点。苏鑫铭[18]构建两端带有lox位点的GPF表达盒GFP-loxP的PRV重组病毒，HAT反向筛选确定其为TK－表型，为进一步利用Cre/lox P系统进行下游的基因工程操作打下良好基础；之后构建了可用于外源基因在含有lox P位点的PRV基因组中快速删除或整合，且能稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系。梁苑燕等[19]首先构建出了带有lox P位点和EGFP的PRV gE－/EGFP+株，通过Cre酶处理后得到不带EGFP的PRV gE－株，之后利用同样的方法得到了PRV gE－/TK－株。吴凤笋[20]在河南一免疫猪场分离出PRV毒株（HNXY），使用传统的同源重组技术结合Cre/lox P系统，分别在gE、TK位置重组了EGFP荧光标记基因，细胞传代筛选出携带荧光的PRV毒株，先后缺失了gE、TK基因且利用Cre酶将EGFP荧光标记基因去除，构建了一株双基因缺失rPRV-HNXY-ΔgE-ΔTK重组病毒。

　　2.3 、细菌人工染色体技术

　　采用细菌人工染色体技术进行病毒重组，是将病毒基因组插入到 BAC载体中，并借助细菌人工染色体进行基因组的保存和修饰。BAC载体的大小约7.5 kb，其本质上是以大肠杆菌的F因子为基础的质粒克隆载体，它可将供体染色体（F+性状标记）高效地转移至受体细胞（F－）。天然F因子是大小约100 kb的双链闭环DNA分子，只有1～2个低拷贝数，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质，在大肠杆菌基因组DNA包装后，大小可达上千kb。人工构建的BAC载体（约7.4 kb），例如pBeloBAC11[21]，保留了在细胞分裂时能保证将低拷贝的BAC质粒精确分配到子代细胞的parA、parB和parC基因，与F因子自主复制功能相关的起始基因（oriS），以及易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶定向基因（repE）。细菌人工染色体具有许多优点：一方面由于病毒启动子在细菌中不能正常工作，病毒基因需要借助细菌聚合酶在大肠杆菌中复制，此过程中病毒基因组不会发生基因突变，遗传特性稳定；另一方面，BAC质粒具有高容量特质，可以容纳300 kb外源基因，且BAC载体上的细菌抗生素耐药性基因方便在大肠杆菌中筛选。近年来快速发展的重组技术，如转座子诱变、基于Rec-A的重组系统、基于Red的重组系统以及Cre/loxP和FLP/FRT重组系统等可以在BACs中快速插入、删除和突变特定序列，均利于进一步深入研究病毒基因功能[22]。

　　PRV在体外环境复制较慢，因此在细胞培养过程中采用传统的同源重组方法构建重组病毒十分复杂，而且重组成功后需对病毒反复纯化耗时费力。长片段DNA克隆的实现有赖于细菌人工染色体技术的突破。在大肠杆菌中，PRV感染性克隆能以单拷贝或极低拷贝质粒的形式进行复制，且不易发生变异，可用多种不同的修饰技术进行遗传操作，具有效率高和操作精度高的特点，将其转染到宿主细胞后可成功拯救出重组病毒。1999年PRV BAC（pBecker1）首次构建成功，该研究将F质粒插入PRV-Becker gG基因上游，尽管pBecker1能在大肠杆菌中稳定增殖，但在转染真核细胞后，F质粒的某些序列会出现自删现象[23]。为了解决这一问题，Smith等[24]将BAC骨架载体插入PRV US9基因poly A序列的上游，并且在mimi-F复制子和Camr基因两侧各引入了一个lox P位点，进一步改进了PRV-BAC的结构。在表达Cre重组酶的动物细胞中转入BAC载体，在两个lox P位点之间的重组反应被Cre酶催化，从病毒基因组上去除BAC载体骨架部分，仅留下34 bp的lox P序列，保证了基因组的保真性和完整性。彭金美等[25]将pBeloBAC Ⅱ载体线性化后插入到带绿色荧光蛋白筛选标记的质粒中，利用同源重组在PRV弱毒疫苗株Bartha K61的TK基因中插入了BAC质粒，获得了重组病毒rv-PRVBAC，且重组病毒在Vero细胞中能稳定遗传。尹文玲等[26]将BAC载体插入到PRV TK基因中，构建了国内强毒分离株PRV-ZJ感染性细菌人工染色体，并在此基础上对该病毒株的基因组做了不同修饰。Zhang等[27]利用同源重组方法将BAC质粒插入PRV HN11201株的TK位点,成功构建PRV BAC,并在此基础上利用Red/ET技术缺失gE/gI基因，构建了三基因缺失vPRV HN1201 TK－/gE－/gI－株。丛鑫等[28]以PRV TJ株为亲本株，通过分段克隆将基因片段依次克隆到pOK12载体中，构建成转移载体pOK-TK-LR-EGFP；利用Cre/lox P系统处理得到含单一lox P位点的重组病毒rPRVTJ-delTK-lox P，提取rPRVTJ-delTK-lox P基因组DNA，将其与pBelloBACII-RFP同时用Cre重组酶处理后，转染Vero细胞，进行重组病毒rPRVTJ-del TK-BAC-RFP拯救。陈利红等[29]将PRV基因组用AcclⅠ酶切使其线性化，再与pBeloBACⅡ转移载体共转染BHK21细胞，拯救出重组病毒并研究其生物学特性。刘娅梅等[30]构建PRV AH02LA株的BAC时将mini-F基因序列替换插入了gE和gI基因的等位位点，构建双基因缺失重组病毒PRV-AH02LA（gE－/gI－），提取病毒环状基因组转化到DH10B中，成功构建PRV AH02LA BAC。陈毓欣等[31]利用病毒重组细菌人工染色体BAC对伪狂犬病毒进行基因修饰，采用Red/ET同源重组技术构建了PRV UL21缺失株，Red/ET重组系统通常利用PCR产物进行重组，通过引物合成方式把BAC重组所需的短同源序列插入到5′突出端，然后将PCR产物电转化到含有所需BAC的大肠杆菌中，重组后的克隆可以通过选择标记筛选出来。

　　2.4、 CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术

　　CRISPR/Cas9技术是一种由向导RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的基因重组技术，因其载体构建简单且靶向效率高而深受研究人员关注。CRISPR/Cas9系统敲除流程如下: Cas蛋白表达，间隔重复序列转录并经过剪切形成短CRISPR的RNA，crRNA通过碱基配对与tracrRNA退火形成复合体，此复合体能特异性识别基因组序列，引导Cas蛋白识别PAM位点，结合到染色体上，在寻找到目标序列后，切割DNA形成双链断裂（Double strand break，DSB），再通过同源重组或非同源末端链接（Non-homologous end joining，NHEJ）修复[32,33]。而通过人工设计的crRNA和tracrRNA，形成具有引导作用的sgRNA（Single guide RNA）。CRISPR/Cas9技术的应用能高效编辑靶向基因，也简化了重组病毒的构建过程。

　　2016年已有研究人员使用CRISPR/Cas9技术对PRV基因组进行基因改造。Xu等[34]利用CRISPR/Cas9成功构建了PRV gE－/TK－株。于之清[35]首次使用CRISPR/Cas9技术直接对病毒基因进行大片段替换编辑，将CRISPR/Cas9基因编辑技术与同源重组相结合，用PRV突变株JS-2012的gB基因取代了PRV经典疫苗株Bartha-K61的gB基因，用低熔点琼脂糖噬斑和PCR对病毒进行纯化和筛选鉴定，获得重组病毒rPRV-BJB。刘继婷[36]采用CRISPR/Cas9技术对PRV HeN1毒株基因组进行快速编辑，先是筛选出有效的sgRNA，将PRV HeN1毒株gE、gI和TK3个基因分别敲除，获得了gE－PRV、gE－/gI－PRV和gE－/gI－/TK－PRV 3株基因缺失毒株，并在小鼠体内进行免疫保护实验，其中gE－PRV和gE－/gI－PRV基因缺失毒株的致病力与亲本毒株HeN1无明显差异，而gE－/gI－/TK－PRV三基因缺失株的毒力相对于亲本株明显降低，对当前流行的PRV变异株HeN1表现出良好的免疫保护作用，促进了研制PRV变异株疫苗的发展。2018年汤艳东等[37]构建了Luciferase萤光素酶和EGFP双报告基因的重组病毒，同时建立了PRV大片段缺失平台，发现了双sgRNA共同介导可提高大片段基因缺失效率。金铭等[38]采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，首先筛选出转染效率较高的细胞系和1对高效编辑 PRV gE基因的sgRNA，通过5轮噬斑克隆纯化，获得1株重组病毒PRV-1-ΔgE，对传代病毒进行测序分析，证实此重组病毒能稳定遗传。

　　2.5、 CRISPR/Cas9和Cre/lox技术联用

　　CRISPR/Cas9技术与Cre/lox技术联用，可以对PRV基因组多个位点同时进行修饰。Xu等[34]利用CRISPR/Cas9和Cre/lox对PRV的gE/TK基因同时进行缺失，成功构建了PRV gE－/TK－株。首先，利用CRISPR/Cas9系统结合同源重组，分别用两侧各有相同方向的lox P和lox N位点的绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（mCherry）重组到PRV野毒株强毒基因gE和TK位点。然后，应用单细胞流式细胞仪加速重组病毒的纯化。随后，利用Cre/lox系统切除GFP和mCherry选择基因。史志斌[39]首先从PRV 4株流行株中筛选出免疫原性最高的HNQYY2012作为亲本株，利用CRISPR/Cas9技术和Cre/lox P系统构建带有lox P位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP+，然后利用Cre酶去除EGFP基因，构建PRV gE基因缺失株 HNQYY2012ΔgE。Li等[40]利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统分别构建了gE/gI基因缺失重组株（rGX?gE/gI）和TK/gE/gI基因缺失重组株（rGX?TK/gE/gI），小鼠免疫实验和猪免疫实验结果均表明，后者的安全性比前者更好。缺失TK/gE/gI基因的重组PRV更安全，可作为具有一定防控作用的PRV候选疫苗。CRISPR/Cas9技术与Cre/lox技术的联用弥补了CRISPR/Cas9技术精确修复率低和同源重组技术重组效率低等问题，便于外源基因的插入和重组病毒的筛选，大幅提高基因编辑效率，缩短疫苗研发周期，使疫苗更好地预防当前流行毒株，达到更佳的免疫效果。

　　3 、结语

　　猪伪狂犬病病毒变异快速，为临床防控带来了新的挑战。而借助稳定、高效的基因重组技术敲除毒力基因和糖蛋白基因，加快研制出针对当前PRV流行毒株的基因缺失疫苗，是对猪伪狂犬病有效防控的关键技术手段。同源重组技术重组效率较低，重组病毒纯化筛选过程也相对较复杂。Cre/lox P位点特异性重组技术对PRV基因进行定位修饰，克服了其他类型重组技术随机整合、引入抗性基因影响上下游基因表达及重组效率低等缺点，但Cre重组酶介导lox P位点间的重组仍需要通过传统的同源重组方法，无法避免同源重组的低效性，需要结合其他方法弥补不足。以BAC为基础克隆的载体，以环状结构存在于大肠杆菌体内，便于筛选和分离纯化，可通过多种不同细菌人工染色体的修饰技术对BAC DNA进行遗传操作，所构建的重组病毒不需要在宿主细胞传代和筛选，构建过程效率高。CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术结合同源重组和非同源重组对PRV进行基因插入、缺失和替换，其操作简易、高效而备受关注。而CRISPR/Cas9技术与Cre/lox技术联用，更便于外源基因的插入和重组病毒的筛选，从而提高了重组病毒的获得效率，而且可以对PRV基因组多个位点同时进行修饰，应用前景广阔。CRISPR/Cas9和多种基因重组技术联用的病毒基因改造策略，对PRV基因改造的发展和重组疫苗的高效研制具有指导意义。

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