含基因STK11的EGFP融合载体对肺癌细胞迁移能力的影响

　　0、引言

　　STK11(serine/threonine kinase 11,STK11)基因最早是从Peutz-Jeghers 综合征(Peutz-Jegherssyndrome, PJS)患者中发现的,目前被认为是一种抑癌基因,参与多个生物学过程和信号通路。我们构建含目的基因STK11的EGFP融合载体转染A549和H460细胞,并探讨其对肺癌细胞迁移能力的影响。

　　1、材料与方法

　　1.1 材料

　　健康者胚肾细胞系293和人肺癌细胞株A549、H460细胞、EGFP-N1、大肠埃希菌DH5α由徐州医学院肿瘤生物治疗实验室保存;人H460细胞购买于南京凯基生物有限公司;引物合成及测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;RPMI 1640培养液购自赛默飞世尔生物化学有限公司;胎牛血清购于浙江天杭生物科技公司;限制性内切酶、连接酶、RT-PCRKit Ver.2试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒中量提取试剂盒均购自北京TIANGEN公司;脂质体(lipofectamine 2000) 购于Invitrogen 公司;STK11抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购于abcam公司。

　　1.2 引物设计及STK11基因扩增

　　根据GenBank的LKB1基因序列(NM000455.4),利用Primer predict和DNAclub软件设计引物,引物由上海英俊生物技术有限公司合成。引物上下游分别引入HindⅢ/KpnⅠ酶切位点。上游引物:5’-ATAGCTAGCATGGAGGTGGTGGACCCG-3’,下游引物:5’-AGAGAATTCCTGCTGCTTGCAGGCC-3’。

　　按照Trizol试剂盒说明书,从293细胞中提取总RNA,获得STK11全长。

　　1.3 重组质粒构建及鉴定

　　将末端加A后的目的基因STK11连接到PMD18-T载体上,得到pMD18-T-STK11重组质粒。分别双酶切质粒pEGFP-N1和pMD18-T-STK11,获得pEGFP-STK11重组质粒。用含阳性克隆的细菌抽提质粒,对质粒pEGFP-STK11进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切,37℃、2h,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。重组质粒送交上海英俊生物技术有限公司进行基因测序,将测序结果与质粒中插入序列的ORF对比,验证重组质粒插入片段的正确性。

　　1.4 转染及实验分组

　　转染前一天,将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化,分别将A549和H460细胞浓度调整至为(2~5)×107cells/ml,接种至6孔板,待细胞铺满板底80%~90%时,按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。实验分pEGFP-STK11重组质粒转染组和0.9%氯化钠溶液对照组。每组6个复孔。

　　1.5 荧光显微镜观测和Western blot检测

　　在转染后12、24、48和72 h荧光显微镜下分别观测两组细胞EGFP的表达情况。分别在转染后24、48和72 h收集细胞,按照细胞蛋白提取试剂盒要求提取蛋白, 80℃冰箱保存,Western blot检测STK11蛋白表达。

　　1.6 划痕实验

　　在6孔板背面画平行直线做标记,每孔3条。

　　分别将两组细胞常规消化后,5×105细胞/孔种植到6孔板内过夜,待细胞基本融合达到80%时,弃去培养液,用PBS清洗三遍后,用10 μl微量移液头在6孔板内垂直于标记纵向划痕,PBS冲洗3次去除细胞,加入无血清培养液继续培养。倒置显微镜下,在3个不同的划痕部位拍照,48h后在同样的位置再拍照观察创伤愈合情况,应用Photoshop软件计算划痕间距。实验重复3次,细胞迁移率=(划痕后即刻测量的划痕间距-划痕后48 h测量的划痕间距)/划痕后即刻测量的划痕间距×100%。

　　1.7 统计学方法

　　应用SPSS19.0软件对实验数据进行统计分析。统计描述、均数采用x±s表示,两组间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　2.1 重组质粒鉴定

　　酶切鉴定结果显示在1 300 bp左右出现条带,与STK11基因大小相同,见图1。对pEGFP-STK11插入片段进行测序,结果显示插入序列无突变,与GenBank中STK11序列一致。

　　2.2 EGFP 表达和STK11基因蛋白表达

　　A549细胞和H460细胞在转染后各时间点,荧光显微镜下均可见pEGFP-STK11重组质粒组细胞呈绿色,细胞形态完好,在转染后24 h EGFP表达最强,见图2;0.9%氯化钠溶液对照组细胞在转染后各时间点,荧光显微镜下均未观察到绿色荧光。在转染后各时间点,Western blot检测结果均显示与目的蛋白分子量一致的目的条带,24 h时条带颜色最深;而0.9%氯化钠溶液对照组未见目的条带表达,见图3。

　　2.3 划痕实验检测细胞迁移能力

　　与划痕后即刻测量相比,各组细胞在划痕后48 h,划痕距离均明显缩小,有融合的趋势,见图4。两种细胞均显示pEGFP-STK1重组质粒转染组划痕较0.9%氯化钠溶液对照组细胞愈合慢,转染组细胞迁移率小于0.9%氯化钠溶液对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且H460细胞迁移率小于A549细胞,见表1。

　　3、讨论

　　STK11基因位于人类染色体19p13.3区域上,DNA全长2155 bp,编码区含1302 bp,包括9个外显子,其转录的mRNA约3.0 kb。STK11编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶包含433个氨基酸残基,功能结构域包含一个激酶区域和氨基端非催化区域的核定位信号通路。STK11虽然最早在PJS综合症中发现,但是有文献报道其在非小细胞肺癌中也有散发性突变,突变率高达30%。据文献报道,我们选择的H460和A549肺癌细胞株STK11基因存在37密码子突变,无STK11蛋白表达。

　　针对这两种细胞株进行STK11重组质粒转染,使之过表达,更有利于研究STK11基因的生物学功能。对我们构建的重组质粒双酶切琼脂电泳可显示1 302 bp的目的基因条带,基因测序与GenBank中STK11序列一致,提示STK11重组质粒成功构建。荧光显微镜检测pEGFP-STK11重组质粒转染组细胞EGFP表达,也提示STK11重组质粒成功构建。Western blot结果显示转染后细胞有STK11蛋白条带出现,表明重组质粒在细胞内正确表达。

　　STK11基因调节多项生物学过程包括细胞生长、细胞周期、极化、转移和能量代谢。高益军等报道STK11通过下游mTOR-HIF-1α信号通路调控肿瘤转移相关基因LOX(lysyl oxidase)而介导肺癌的转移,LOX上调可激活β-1-integrin信号通路,增强细胞的侵袭能力。文献报道,在临床上观察到发生远处转移的肺癌患者中STK11突变率增高。我们的细胞划痕实验提示,重组质粒转染组细胞有细胞划痕愈合减慢的现象,初步证实STK11有抑制肺癌迁移作用。我们下一步会采用Transwell等方法进一步验证STK11基因的迁移抑制作用,并通过检测Lox、Pdgf R和Vegfc等转移基因来探讨其可能机制。