石油微生物学中基因工程技术的应用

　　摘    要：　对基因工程在生物驱油技术、生物恢复和生物燃料等三方面的应用进行了综述.通过基因工程改造,能够提高驱油微生物对开采环境的耐受性以及有益代谢产物的积累增加驱油效率;能够构建高效清除漏油产生的污染物质的重组微生物,实现低成本、环境友好的生物恢复;能够获得生产可再生的清洁生物燃料,例如纤维乙醇,其能促进汽油的充分燃烧,降低二氧化碳等污染物的排放.

　　关键词：　石油微生物; 基因工程; 生物驱油技术; 生物恢复; 生物燃料;

　　Abstract：　Summarized the application of gene engineering on microbial enhanced oil recovery, bioremediation and biofuels. Utilization of gene engineering can increase the efficiency of microbial enhanced oil recovery, construct the recombinant strains for high-efficiency degradation of the spilled petroleum to realize the low-cost and eco-friendly bioremediation, and produce the clean and renewable biofuels which may improve the combustion efficiency of diesel and reduce the contaminants such as carbon dioxide.

　　Keyword：　petroleum microbiology; gene engineering; microbial enhanced oil recovery; bioremediation; biofuels;

　　0、 引言

　　石油是一种黏稠、深褐色的液体,由不同烃类化合物和其他有机化合物组成的复杂混合物,其中包括一些有机金属组分,主要是矾和镍化合物.目前,88%的石油被开采为燃油和汽油,是世界上最重要的一次性能源之一,剩余的12%被加工为多种化工产品,如石蜡、润滑试剂、化肥、塑料和杀虫剂等.石油是地球上的不可再生资源,并且其价值昂贵,被誉为“工业的血液”和“黑金”.如果石油资源枯竭,会导致人类面临诸多困境.因此,如何提高石油开采和利用的高效性,是学术界和工业界共同关注的问题.

　　生物技术是基于生物学、化学和工程学的基本原理,利用生物体(包括动物、植物以及微生物)或者其组成部分生产有价值的物质产品的技术过程,主要分为基因工程、蛋白质工程、细胞工程和发酵工程等.随着现代生物技术的飞速发展,以及地球上石油资源的逐渐减少,生物技术与石油工程的关系也越来越密切.石油微生物学是微生物学的一个分支,负责研究能够代谢或转化原油以及精炼石油产品的所有微生物,包括细菌、产甲烷古生菌和一些真菌.石油微生物学技术的应用主要包括生物勘探开采、生物驱油技术、生物恢复、生物表面活性剂(biosurfactant)以及生物能源.基因工程是通过分子生物学技术改变细胞遗传物质,获得新的生物遗传性状,最终达到新产品的生产或者极大提高原产品产量的技术.目前,基因工程在石油微生物学研究中也成为热点之一.

　　1 、基因工程在石油微生物学的应用

　　1.1、 生物驱油技术(microbial enhanced oil recovery)

　　据估测,在一个油藏中仍然有三分之二是未被开采的原油.传统技术即通过钻井或者压力差方法,只能获得5%～10%原始油层[1],采用驱油方案,例如向原始油层注入一些化学物质包括表面活性剂、乳化剂、聚合物、酸、分散剂等,降低原始油层的开采难度,可以使采油量增加10%～40%[2,3].然而,这些方法不仅极大地增加成本,还会对产品自身带来质量的损害,产生一些毒害物质,造成严重的环境问题,非常不符合可持续发展方针.1926年,微生物驱油技术首次被提出,利用微生物或者微生物代谢产物提高驱油效率,是成本节约、环境友好的方法[2].一般来说,自然界存在的天然微生物都具有一定的局限性,例如,一种微生物能够产生大量的生物表面活性剂,却不能耐受开采环境(不适宜的pH、温度、压力等);相反,其他一些具有耐受性的菌株,却不能产生足够的表面活性剂.因此,基因工程改造石油类微生物,获得一种既能耐受开采环境,又能生产大量次级代谢产物的菌株,是生物驱油技术必然的发展趋势. 在中海油渤海SZ36-1油田,筛选有效激活体系,激活地层中有益微生物菌群,乳化分散原油、降低原油黏度,达到增强驱油效率的目的,效果良好.
 

　　为了获得更高效的微生物菌株,基因再编辑、原生质体融合以及点突变被广泛应用于相应的底盘细胞中.革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)能产生不可溶的多聚物,用于增加底层渗透率,其产量可达到7.28 g/L.但是,阴沟肠杆菌的最适生长温度是37 ℃,最适生长pH为5～7.SUN S等为了提高菌株的温度耐受性,将来源于嗜热杆菌(Geobacillus)的基因组DNA提取后,电转化到阴沟肠杆菌细胞中,经过基因重组,得到了一株能够在54 ℃培养条件下,稳定生产生物多聚物,产量远远超过了野生型菌株,达到了8 g/L.同时,重组菌株具有稳定的遗传性状,通过岩石驱替实验证明其确实能有效地促进驱油效率[4].此外,SUN等还通过原生质体融合手段,将阴沟肠杆菌和嗜热杆菌进行了细胞融合,得到一株杂合菌株,既提高了最适生长温度,也增加了菌株的最适生长pH范围(pH 7～9),同时,杂合菌株的多聚物产量仍然达到了7.5 g/L[5].烷基化合物也是原油的主要成分,将其从长链降解为短链烷基化合物,是生物驱油的重要手段之一.来源于芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)单加氧酶LadA能催化饱和烷烃氧化为链烯醇类,完成长链烷烃(C15-C36)的裂解.为了提高LadA的催化活性,采用随机点突变手段,建立了随机筛选文库,获得了酶活性,提高了2～3.4倍的突变体,含有突变体酶的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)生长明显快于含有野生型酶的菌株[6].这些实验结果表明,基因工程技术在生物驱油技术中具有非常重要的作用.

　　1.2、 在生物恢复(bioremediation)中的应用

　　生物恢复是一种利用生物体将有害物质分解成毒性较底或者无毒物质的处理方法,具有成本低、环境友好、应用范围广等特点.漏油产生的污染性物质是复杂多样的,仅通过自然界中的天然微生物完成全部清除效果,是难以实现的过程.因此,科学家们开始关注基因工程改造微生物菌株的构建,以期突破已有方法的限制,实现生物恢复的快速、彻底以及高效性.

　　首先,通过基因工程手段,解析天然石油降解微生物的代谢途径和关键酶.例如,对多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon,PAH)降解的微生物恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),其萘分解代谢质粒上的第一个操纵子 (nahAaAbAcAdBFCED)编码了将萘转化为水杨酸的酶类,第二个操纵子(nahGTHINLOMKJ)则编码负责催化水杨酸转变为乙醛和丙酮酸,其中,萘双加氧酶在PAH的降解中发挥了关键性的作用,其具有底物非特异性,能催化多种PAHs的化学反应[7,8].通过对萘分解代谢途径和酶的生化分析,能够极大地促进其他PAHs包括菲和蒽化合物的降解.

　　其次,将已知的代谢途径进行改造、调控以及扩展,实现一种重组微生物的多功能化.工程菌株荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens),含有异源萘代谢途径的质粒,以及由感应萘代谢的启动子调控的生物发光基因lux基因,这样重组菌既可以降解萘化合物,也能实时检测降解的效率.利用该工程菌株能够完全清楚土壤样品中的PAH[9].二苯并噻吩是加氢脱硫处理燃料过程的常见含硫杂环化合物,红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)本身具有催化二苯并噻吩脱硫的一系列酶,包括dszA、dszB和dszC,从而消除该化合物的毒性和污染性.目前,红串红球菌已经成为商业脱硫流程中的担当菌株[10].将红串红球菌dsz家族的酶通过异源启动子的作用,在假单胞菌中表达后,由于异源启动子不含有硫化物抑制区域,重组菌株极大限度地降低了对硫化物的敏感度,其消化二苯并噻吩的能力远高于野生型的红串红球菌.这些研究成果表明基因工程在石油生物恢复中也扮演着十分重要的角色[11].

　　1.3、 生物燃料(biofuels)

　　生物燃料是利用可再生资源例如玉米、大豆、纤维素等生物质转化成的燃料,包括燃料乙醇、生物柴油等.将生物燃料按一定比例掺入汽油中,可以部分甚至完全替代石油资源,降低油耗量,同时能促进汽油的充分燃烧,降低二氧化碳等污染物质的排放.生物燃料的生产主要包括两种方式:一种是利用玉米等粮食为原料;另一种是通过转化地球上最为丰富的可再生资源——纤维素.然而,由于大量使用农产品为原料,势必会导致生物燃料“与人争粮”的现象更加严重.因此,科学家们开始利用基因工程技术,以木质纤维素为原料,研发高效生产生物燃料的途径,并获得了一定的成果突破.

　　纤维素的降解需要复杂的纤维素酶系,其中最基本的三种酶分别是负责从纤维素内部开始水解产生纤维二糖和纤维寡糖的内切葡聚糖酶(endoglucanases,EG),从纤维素两端进行水解的释放纤维二糖的外切葡聚糖酶(cellobiohydrolases,CBH)和将纤维二糖和纤维寡糖分解形成葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases,BGL1).通常,一种微生物具有纤维素酶降解体系,却不具有生物燃料合成途径,反之,具有生物燃料合成途径的微生物,却不含有纤维素酶体系.克服这一问题的方案,即将两种体系融合到一种微生物中,使重组菌株既能高效降解纤维素底物,也能工业化生产生物燃料.酿酒酵母作为传统的乙醇发酵菌株,被广泛地用作底盘细胞,构建纤维素酶表达体系,最终实现纤维乙醇的生产.

　　同步糖化发酵(Simultaneous saccharification and fermentation,SSF)是将纤维素酶对纤维素底物的降解过程和酿酒酵母发酵过程同时进行的工艺,能消除酶水解过程中产生的葡萄糖和纤维二糖的反馈抑制作用,提高乙醇的产量[12,13].然而,一般纤维素酶系中都缺乏BGL1的活性,严重影响了纤维素酶的降解活性[14,15].因此,将BGL1在酿酒酵母中高效表达,是提高SSF的有效途径.TANG等通过比较三种来源的葡萄糖苷酶的活性,发现来源于扣囊覆膜胞酵母的BGL1具有最高的表达活性,并且该工程菌能够利用酸处理玉米芯发酵乙醇,乙醇的产量达到了21.5 g/L,比野生型菌株提高了89%[16].SSF在工业应用上具有一个限制性因素,即纤维素酶的表达、分离和纯化成本昂贵.近些年,生物统和加工过程(consolidated bioprocessing,CBP)将纤维素酶和半纤维素酶的表达、纤维素降解以及乙醇发酵在同一个过程中完成,这是实现纤维素底物转化乙醇的有效途径之一.CBP有利于减少生物燃料转化过程的成本,并简化生产工艺.在酿酒酵母中,将三种纤维素酶CBH、EG和BGL1同时共表达,可以实现纤维乙醇的CBP.根据文献报道,将CBH、EG和BGL1分别在酿酒酵母中异源分泌表达,利用几种重组菌株的共培养,同时分泌这几种酶到发酵液中,从而达到纤维乙醇的高效生产,产量可达到14 g/L[17].此外,纤维素酶还被自组装到酿酒酵母的细胞表面上,形成人造纤维小体复合物,从而达到纤维乙醇的CBP,但是目前的研究仍然处于初级阶段[18].

　　2 、展望

　　综上所述,基因工程已经开始应用于石油微生物领域中,改造后的工程菌在遗传性状和生物表型上都具有明显的优势.但是,对于石油微生物基因工程改造的研究,仍然相对比较落后,限制性因素主要包括三方面:第一,对微生物本身代谢途径、信号转导通路以及转录调控机制的阐述还不清楚;第二,具有良好作用的异源代谢通路与宿主微生物的兼容性不够;第三,也是最重要的一个因素,由于石油生产具有成熟的传统工艺,使科研工作者在一定程度上忽略了生物技术在石油微生物方面的应用.未来,随着生物技术的飞速发展和石油资源的短缺,基因工程与石油微生物工程改造的联系将会越来越密切.

　　参考文献

　　[1] SEN R.Biotechnology in petroleum recovery:The microbial EOR[J].Progress in Energy and Combustion Science,2008,34 (6):714-724.
　　[2] BELYAEV S S,BORZENKOV I A.NAZINA T N,etc.Use of Microorganisms in the biotechnology for the enhancement of oil recovery [J].Microbiology,2004,73 (5):590-598.
　　[3] LAZAR I,PETRISOR I G,YEN T F.Microbial enhanced oil recovery (MEOR) [J].Petroleum Science and Technology,2007,25 (11):1 353-1 366.
　　[4] SUN S,ZHANG Z,LUO Y,et al.Exopolysaccharide production by a genetically engineered enterobacter cloacae strain for microbial enhanced oil recovery [J].Bioresource Technology,2011,102 (10):6 153-6 158.
　　[5] SUN S,LUO Y,CAO S,et al.Construction and evaluation of an exopolysaccharide-producing engineered bacterial strain by protoplast fusion for microbial enhanced oil recovery [J].Bioresource Technology,2013,144:44-49.
　　[6] DONG Y,YAN J,DU H.Engineering of LadA for enhanced hexadecane oxidation using random-and site-directed mutagenesis [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,94 (4):1 019-1 029.
　　[7] EATON R W,CHAPMAN P J.Bacterial metabolism of naphthalene:construction and use of recombinant bacteria to study ring cleavage of 1,2-dihydroxynaphthalene and subsequent reactions [J].Journal of Bacteriology,1992,174 (23):7542-7554.
　　[8] SIMON M J,OSSLUND T D,SAUNDERS R,et al.Sequences of genes encoding naphthalene dioxygenase in pseudomonas putida strains G7 and NCIB 9816-4 [J].Gene,1993,127 (1):31-37.
　　[9] SAYLER G S,RIPP S.Field applications of genetically engineered microorganisms for bioremediation processes [J].Current Opinion in Biotechnology,2000,11 (3):286-289.
　　[10] GRAY K A,POGREBINSKY O S,MRACHKO G T,et al.Molecular mechanisms of biocatalytic desulfurization of fossil fuels [J].Nature Biotechnology,1996,14:1 705.
　　[11] GALLARDO M E,FERRáNDEZ A,DE LORENZO V,et al.Designing recombinant pseudomonas strains to enhance biodesulfurization [J].Journal of Bacteriology,1997,179 (22):7 156-7 160.
　　[12] 张宁,蒋剑春,程荷芳,等.木质纤维生物质同步糖化发酵(SSF)生产乙醇的研究进展 [J].化工进展,2010,29 (2):238-242.
　　[13] STENBERG K,BOLLóK M,RéCZEY K,etc.Effect of substrate and cellulase concentration on simultaneous saccharification and fermentation of steam-pretreated softwood for ethanol production [J].Biotechnology and Bioengineering,2015,68 (2):204-210.
　　[14] MERINO S T,CHERRY J.Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization [J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2007,108:95-120.
　　[15] NAGAR S,GUPTA V K,KUMAR D,et al.Production and optimization of cellulase-free,alkali-stable xylanase by Bacillus pumilus SV-85S in submerged fermentation [J].J Ind Microbiol Biotechnol,2010,37 (1):71-83.
　　[16] TANG H,JIN H,YU S,et al.High β-glucosidase secretion in Saccharomyces cerevisiae improves the efficiency of cellulase hydrolysis and ethanol production in simultaneous saccharification and fermentation [J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,23 (11):1 577-1 585.
　　[17] LEE C R,SUNG B H,LIM K M,et al.Co-fermentation using recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast strains hyper-secreting different cellulases for the production of cellulosic bioethanol [J].Scientific Reports,2017,7 (1):4 428.
　　[18] 汤红婷,侯进,沈煜,等.酿酒酵母人造纤维小体的研究进展 [J].生物加工过程,2014(1):94-101.