杨树抗逆相关基因的克隆和转化研究

　　杨树是重要的速生丰产工业用材、绿化建设、防护林和生物质能源树种之一，具有较高的经济价值和生态效益。杨树的基因组较小，基因组测序已完成，因此，杨树被作为模式林木树种应用于木材的形成、抗逆性遗传改良等方面的研究[1].20 世纪末至 21 世纪初，我国建造了超过 1 000 万 hm2的速生林基地，杨树占重要部分。随着杨树人工林的大面积推广，杨树的抗逆性明显降低，病虫害的发生和危害逐渐加重，培育杨树抗病新品种迫在眉睫。由于杨树生长周期长、树体高大，采用传统育种方法在短时间内培育抗病新品种较困难。随着分子生物学和基因工程技术的发展，植物抗逆机理研究的深入以及某些抗逆相关基因的克隆和转化，为杨树抗逆遗传改良开辟了一条新途径[2 -3].

　　1 转基因杨树抗病虫研究

　　1. 1 抗病研究

　　1. 1. 1 抗病毒病 抗病毒基因工程研究在林业上的应用才刚起步，目前，使用的基因主要有洋李痘病毒的外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因等几种。Cooper、李玮等分别将花叶病毒外壳蛋白基因和抗菌肽 LCI 基因导入杨树中，均获得良好抗病效果的转基因植株[4 -5].

　　1. 1. 2 抗细菌病 农杆菌感染杨树后，杨树极易感染冠瘿病。目前，关于杨树抗冠瘿病的研究主要是采用转基因技术将农杆菌致瘤基因、激素 IAA 基因、抗菌肽基因（ 兔防御素NP -Ⅰ 基因） 导入杨树，获得抗性提高的转基因植株[6].

　　1. 1. 3 抗真菌病 植物受到病原物侵染后，会使多种病程相关蛋白迅速表达，参与其抗病防卫反应。在这些病程相关蛋白中，最主要的蛋白之一就是几丁质酶[7],几乎所有的植物器官中均可以发现几丁质酶[8].在正常情况下，几丁质酶水平很低，但经诱导因子的诱导，表达量可以迅速增加。病原真菌、细菌、病毒的侵染、激发子和一些逆境等均可能诱导植物几丁质酶的表达[9].近年来，有关对植物几丁质酶的特性、基因结构、分类、分子进化、生物学作用及转几丁质酶基因的研究，已成为植物抗真菌病害的研究热点之一[10 -11].1991年，Broglie 等首次对转几丁质酶基因在植物的抗真菌病方面进行了研究，他们将菜豆几丁质酶基因转入烟草和油菜，并得到表达，有效降低了植株的死苗率，控制了病情的发展[12].

　　但转基因烟草植株对病原真菌的抗性没有明显提高。进一步研究证明，几丁质酶同工酶类型及其在植物体内定位的不同，将影响基因的表达和植株的抗病性。

　　Nicolescud 等分别将矮牵牛黄酮合成酶基因、草酸氧化酶基因、几丁质酶基因导入杨树，均获得了具有一定抗性的转基因植株[13 -15].王琼等以受落叶松 - 杨栅锈菌单孢子堆菌系 Sb052 侵染的川杨叶片为材料，采用 RACE 技术克隆川杨几丁质酶基因DNA 全长，通过荧光定量表达分析，推测 PsChi I基因参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制[16].

　　1. 2 抗虫研究

　　食叶害虫和蛀干害虫是危害杨树的 2 类主要害虫，包括杨尺蠖、舞毒娥、杨扇舟蛾、光肩星天牛、桑天牛、云斑天牛等。目前，国内外用于杨树抗虫基因工程研究的外源基因主要有苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因、抗菌肽基因、昆虫特异性神经蝎毒素基因、几丁质酶基因、多酚氧化酶、脂氧化酶、胆固醇氧化酶，以及 Vip3A 等，但对于杨树转 Bt 基因的研究最为深入，发展也最为迅速[17 -19].

　　1. 2. 1 苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因 从苏云金杆菌的芽孢中分离出来的 Bt 杀虫晶体蛋白，现今已发现 60 多种，一般用 Cry1、Cry2、Cry3、Cry4 和 Crt 来表示，划分的主要依据是由其杀虫谱范围和基因序列的同源性来决定[20].Bt 毒蛋白是一个单基因产物，1981 年 Schnepf 等首次将苏云金杆菌 Kurst-aki HD - 1 的 Bt 毒蛋白基因克隆[21].该基因的 mDNA 在植物中表达量较低，不稳定，同时也不会改变原氨基酸序列，从而使这些毒蛋白的基因表达量提高了上百倍[22 -23].鉴于 Bt毒蛋白具有高度专一性、生物降解性，且对人畜无害的安全性，被作为转基因植物抗虫基因工程中理想的杀虫目的基因[24].目前，已有许多转 Bt 基因植物问世，有的已进入大田试验和商品生产阶段[25].国内外关于转 Bt 基因在杨树方面的研究，主要集中在欧洲黑杨、美洲黑杨、欧美杨和杨树杂种NC5339（ Populusdehoides alba × P. grandidentata） 、NL - 80106（ P. × P. simonii） 、741 杨[P. alba × （ P. davidiana + P.simonii） × P. tomentosa]等品种上，这些转 Bt 基因杨树均具有一定的抗虫效果[26].最早见于报道的是用 Bt CryIA 基因转化欧洲黑杨，通过 Southern 杂交证明外源基因的成功转入[27].此后，抗虫转基因研究就拉开了帷幕。广大研究工作者围绕 Bt 基因[28 -33],以及 Bt 嵌合基因[34 -35]、Bt 双元表达载体[36]、Bt 双价抗虫基因[37 -38]在杨树中的抗虫性进行了广泛研究，并取得了明显的抗虫效果。

　　1. 2. 2 蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂是对蛋白水解酶有抑制活性的一种水分子蛋白质，普遍存在于植物、动物和微生物中[39].迄今为止，自然界共发现四大类蛋白抑制剂： 丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。目前，用于转化杨树的主要有丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因[40].McNabb 等首次将马铃薯蛋白酶抑制剂基因导入 NC5339 无性系，转化获得抗虫杨树[41].Klopfenstein 等分别利用马铃薯的蛋白酶抑制剂与 NPT,以及大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、水稻巯基蛋白抑制剂基因和 Bt Cry（ A） 构成的嵌合基因导入杨树，获得转基因植株[42 -43].郝贵霞等将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因成功地导入了毛白杨，经 PCR 和 PCR - Southern 检测证实基因已整合进杨树基因组中[44].

　　1. 2. 3 昆虫毒性基因 昆虫特异性神经毒素是从胡蜂、蝎子、蜘蛛的毒液中分离到的一些小肽（ 30 ~ 40 个氨基酸） ,是一类作用于昆虫神经系统并具有毒杀作用的蛋白类神经毒素。这类毒素只作用于昆虫而对哺乳动物和其他动物无害或者毒性很小，是一种十分理想的抗虫基因源[45].伍宁丰等将抗虫的蝎神经毒素基因导入黑杨无性系 N - 80106 中，通过根癌农杆菌将构建在双子叶高效表达载体上的已优化了密码子的 AaIT 基因转化杨树杂种 NL - 80106（ Populusdeltoides ×P. sinonii） ,得到了转基因植株[46],通过 PCR、PCR - Southern杂交和 ELISA 分析，证实了转基因植株中 AaIT 基因的表达，转基因植株对 1 龄舞毒蛾幼虫的效果最好，具有明显抗虫性。

　　1. 2. 4 其他抗虫基因 近年来，陆续开展了植物凝集素基因、脂氧化酶、多酚氧化酶、胆固醇氧化酶及 Vip3A 等编码基因在杨树抗虫方面的应用研究，取得了一定的进展[47 -48].