基因工程论文
柑橘属 （ Citrus） 是全球产量最大的水果，同时我国柑橘年产量位居全球第一[1].柑橘是亚热带植物，喜温暖，对低温的反应敏感，所以低温是影响柑橘品质和产量的重要制约因素。同时低温影响柑橘的区域分布，限制柑橘这一重要经济植物在我国广大北方地区的栽培种植。因此，研究柑橘寒敏感原因，培育柑橘耐寒品种，对于提高柑橘品质和产量，打破柑橘地域，促进柑橘产业快速发展具有重大意义。
基因差异表达分析技术是寻找植物抗性基因的重要技术手段，而基因工程是获得植物抗性品种的重要方法，因此利用基因差异表达和基因工程技术能够获得柑橘抗寒相关基因，揭示柑橘寒敏感本质，有助于今后通过人工方法，调控柑橘抗寒过程，提高柑橘抗寒性，培育柑橘抗寒品种。迄今为止，已有 80 多篇涉及柑橘抗寒基因研究的文章发表，这些文章从柑橘属植物温州蜜柑、葡萄柚、甜橙中，分离鉴定了一部分低温差异表达基因，分析了这些基因与植物抗寒性之间的关系，并通过基因工程转化了部分柑橘类寒敏感品种，从而增加柑橘抗寒性。
1 柑橘抗寒相关基因获得方法
高等生物的基因表达不仅受到发育和组织特异性的影响，而且还受到环境变化的影响。任何细胞的基因 90% 是基础性表达，只有 10% 是选择性表达。而生物表现出来的各种特性，正是由于这 10%基因的差异表达导致的，这里面包含了新基因的表达与表达量差异基因的表达。所以，分析低温诱导下不同基因的表达差异，并克隆这些差异表达的基因与模式植物比对了解其抗寒功能，对于深入研究柑橘抗寒分子机理，获得柑橘抗寒基因，转化柑橘寒敏感品种，提高柑橘抗寒性具有重要作用。
获得柑橘低温差异表达基因的主要技术有mRNA 差异显示 （ mRNA differential display） 、差别杂交 （ differential hybridization） 、交互扣除 RNA 差别显示技术 （ reciprocal subtraction differential RNAdisplay） 、 扣 除 杂 交 （ subtractive hybridization ofcDNA） 、抑制消减杂交法 （ suppression subtractivehybridization ） 、 定 量 （ quantitative interpretation ）PCR、 半 定 量 （ semi-quantitative interpretation ）PCR、电子消减 （ electronic subtraction） 、基因表达系列 （ serial analysis of gene expression） 分析和DNA 微列阵分析 （ DNA microarray）[2].
2 柑橘抗寒相关基因及其作用
Weiser[3]在 1970 年首先提出，植物在抗寒性诱导过程中基因表达发生了改变。随后利用各种基因差异表达分析技术，已在苜蓿、菠菜、冬小麦、马铃薯和冬油菜以及其他植物中，分离鉴定了多个与植物抗寒性相关的低温诱导基因[4],而柑橘植物的抗寒相关基因也在研究中越来越多地被分离鉴定出来。
在柑橘的抗寒性基因研究中，柑橘被认为是对低温比较敏感的植物，而同为芸香科柑橘亚科的枳是与柑橘亲缘关系很近的柑橘类植物，常用做柑橘砧木，对低温抗性好，耐寒[5],是研究柑橘抗寒性很好的比较材料。在柑橘抗寒能力的研究过程中，科学家通过各种差异表达分析法在低温胁迫的柑橘和枳中分离鉴定了一些低温诱导基因，而这些基因的功能大多通过与模式植物中已知功能的抗寒基因进行同源序列比对得知，并比较其抗寒性的差异，分析柑橘寒敏感分子机理，旨在获得能够提高柑橘抗寒性的基因。陈文荣等[6]利用 mRNA 差异显示技术分析鉴定寒敏感佛手低温胁迫相关的基因，最终获得 121 个低温差异片段，经过半定量和生物学分析，最终确定 29 个上调基因和 5 个下调基因，这些基因主要涉及植物防御/应激反应，信号转导，细胞壁修饰，转录，蛋白质的合成和氨基酸转运。张真真[2]研究了低温胁迫前后这些基因在佛手和枳的表达量变化情况，其中 14 个基因在佛手中的表达发生变化，但在枳中表达量却不变，这些基因可能与佛手寒敏感相关，它们所介导的分子途径可能是揭示佛手寒敏感特性的有利证据。近15 年来，柑橘类植物低温胁迫后分离鉴定的低温诱导基因列于表 1.在低温胁迫后，植物能够诱导体内表达某些基因，这些基因的表达蛋白直接参与低温胁迫应答或间接调控其他靶基因的表达[20].陈得波等[21]归纳了自马铃薯、黑麦、小麦、菠菜、苜蓿和大麦以及其他植物里面分离鉴定的 62 个低温诱导基因，这些基因与植物抗寒能力有关系，而且这些基因的作用与膜脂相变、抗冻脱水、抗冻活性及低温下酶活性的变化有关。从表 1 中已经获得的柑橘类植物低温诱导基因，分析其合成的蛋白在抗寒中的作用可以分为 3 大类： 1） 编码具有催化作用的蛋白；2） 促进新蛋白生成并附着细胞膜的表面或者镶嵌在膜脂之间，对于细胞膜的冷稳定性有促进作用；3） 作为蛋白调节因子在信号转导和低温表达过程中起调节作用。下面对已经被分离鉴定的与柑橘低温诱导相关基因在抗寒方面的作用进行介绍。
2. 1 酶活性蛋白
柑橘在低温胁迫过程中诱导合成具有催化作用的蛋白，参与一些重要的生理活动，如苯丙氨酸解氨酶 （ PAL）[19]、ACC 合成酶[18]、硫氰酸酶[6]、甘油-3-磷 酸 酰 基 转 移 酶[22]、核 苷 二 磷 酸 激 酶Ⅲ[16]、氨基酸透酶[16]、酮还原酶[11]等。
苯丙氨酸解氨酶 （ PAL） 是催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶和限速酶。Sanchez-Ballesta等[19]从经低温胁迫下寒敏感的福琼橘 （ Fortune）和耐寒的赫南蒂娜克力迈丁红橘 （ Hernandina） 中分离获得 2 个全序列 PAL1 和 PAL2.研究发现低温胁迫后寒敏感柑橘的 PAL 表达量升高而耐寒柑橘的 PAL 表达量和 PAL 活性均下降，表明低温胁迫下 PAL 的表达量积累与柑橘受到低温伤害有关，PAL 表达量的变化是区分柑橘品种抗寒性强弱的一种指标。
氨基环丙烷羧酸 （ ACC） 合成酶基因 ACS,是编码乙烯合成的关键酶，乙烯主要调节植物的生长发育及多种生理反应，如植物逆境胁迫反应。
Wong 等[18]从低温胁迫的甜橙中分离鉴定了 2 个低温诱导表达的 ACC 合成酶基因 ACS1 和 ACS2,这2个基因不仅被低温诱导表达，同时也被伤害诱导表达。
硫氰酸酶具有植物组织解毒作用，能使细胞中有毒的氰化物，转变为无毒的硫氰酸化合物。陈文荣等[6]在寒敏感的柑橘植物佛手中，获得硫氰酸酶基因，这说明即使是抗寒性差的柑橘植物种，也同样会产生抗寒物质，用于对抗低温下氰化物积累对细胞造成的伤害。
Lang[16]和 Zhang 等[11]利用 mRNA 差异显示和定量 PCR 技术，从低温驯化的温州蜜柑中获得 6个正调控低温诱导基因，其中 2 个基因编码具有催化作用的氨基酸透酶 6 和核苷二磷酸激酶Ⅲ。从低温驯化的枳中获得 8 个正调控基因，其中 1 个编码具催化作用的酮还原酶。
2. 2 冷保护蛋白
低温伤害的主要部位是生物膜，研究表明低温胁迫过程中柑橘诱导新的蛋白质合成，附着于膜表面或位于膜脂间，具有保护细胞生物膜，维持水相，及防止蛋白变性等功能。如防止蛋白质受冻而失活的 COR （ cold-regulated） 蛋白[8,15],保护细胞机能及抗脱水的 LEA （ late-embryogenesis abundant）蛋白[8],及一些与 LEA 蛋白、脱水蛋白类似的蛋白[23 -25].在柑橘植物中报道最多的 COR 基因有 COR11,COR15,COR19,这 3 个基因受低温、高盐、干旱等逆境诱导，能形成一类独特的 LEA 蛋白基因家族，均与柑橘的抗寒性相关。Porat 等[8]从葡萄柚中获得 COR15 基因，编码一个 15. 1 ku 的蛋白质COR15.Hara 等[15]从低温驯化的温州蜜柑叶片中获得 COR19 基因，从枳中获得 CORc115 基因和CORc119 基因，分别编码蛋白质 COR19 和 COR11.这 2 种基因和温州蜜柑低温诱导表达的 COR19,氨基酸序列都富含赖氨酸丰富区[24],且高度同源。