基因工程论文
温州蜜柑作为柑橘中抗寒性较强的品种，在低温胁迫下与抗寒性极强的枳均有 COR19 类似蛋白的表达形成，表明该基因可增加温州蜜柑的抗寒性。
另外 Guy 等[25]在低温驯化柑橘叶片里，观察到脱水蛋白 CAP160 和 CAP85 的累积，这体现出脱水蛋 白 参 与 了 柑 橘 的 抗 寒 过 程。而 且 柑 橘 的CAP160 与菠菜的 CAP160 无论分子量还是等电点都很相似，这体现了即使没有亲缘关系的植物同样也能生成一样的抗寒蛋白。2011 年 Porat 等[17]在甜橙和葡萄柚热激后的低温诱导过程中获得脱水蛋白基因 DHN,热激后冷藏时 DHN 的表达量明显增加。同时，发现葡萄柚在热激后放在常温下，被诱导增加表达的 DHN 是短暂的，而如果把热激后的葡萄柚进行冷藏，其诱导提高的 DHN 水平可以维持 8 周。Porat 等[26]也曾有研究证实，柑橘冷藏前进行热处理可以提高柑橘储藏期间抗寒性。
2. 3 植物的 AFP 抗冻蛋白
抗冻蛋白 （ antifreeze protein,AFP） 首先发现于极地的鱼类中，它们与其他冷诱导蛋白的基本区别是： 降低溶液冰点、抑制重结晶、修饰冰晶形态[27].抗冻蛋白 AFP 已在冬黑麦、小麦、大麦、胡萝卜、燕麦、冬青、苔藓、裸子植物、细菌及真菌等生物中被发现[28 -29],目前未见柑橘类植物获得 AFP 的报道。
2. 4 转录因子
转录因子 （ transcription factor） 指能结合基因上游特异核苷酸序列的蛋白质并起到调控基因转录的作用，转录因子与植物抗逆、发育及生命活动调控有重要联系。转录因子的调控作用研究一直是柑橘抗寒研究的热点，其中 CBF （ CRT/DRE bindingfactor） 是目前柑橘中研究最深入的，参与低温逆境应答的转录因子。CBF 是启动低温调节基因表达的重要转录因子，含有 AP2结构，该结构域能与 COR 基因的 CRT/DRE 结合，启动 COR 蛋白，从而提高植物抗寒性[30].2007 年 Champ 等[5]从枳和葡萄柚中分离获得 CBF,低温诱导下枳的 CBF1比葡萄柚的 CBF1 积聚更多且达到更高的表达水平，而且枳的 CBF1 能够更迅速地识别并结合CRT / DRE 片段，从而更早并更高水平地表达冷保护蛋白 CORc115,从而增加枳的抗寒性。这项研究首次为 2 种亲缘关系相近但是抗寒性差距较大的柑橘植物，提供其抗寒差异与 CBF 表达 （ 数量、时间） 和低温胁迫程度相关性的证据。
乙烯应答因子 （ ethylene response factor,ERF）转录因子家族基因也受低温胁迫诱导表达，同样具有 AP2结构，也在柑橘抗寒中起着重要作用。2011年曹诣斌等[12]通过 RACE 扩增从枳和佛手中获得ERF6,并使用定量 PCR 技术发现抗寒性不同的枳和佛手的 ERF6 低温胁迫下表达变化量完全不同，低温胁迫下佛手的 ERF6 表达量上升 12 倍，而枳的 ERF6 表达量上升 4 000 倍，说明 ERF6 表达量的变化与柑橘品种的抗寒性差异呈现正相关。2006年 Sahin-Cevik 等[9]通过扣除杂交法在枳的低温诱导 cDNA 文库中筛选获得 Pl-B05 和 Pl-C10 2 个基因，均含 AP2/ ERF 结构域。在寒冷的不同时期对枳和葡萄柚的这 2 个基因表达量进行分析，发现这2 个基因在枳中被诱导表达，葡萄柚中未被表达，说明 ERF 转录因子与柑橘抗寒性具有重要相关性。
GRAS 是高等植物特有的转录因子家族，参与植物的生长发育、解毒作用、信号转导、生物和非生物胁迫的应答过程[31].叶杰君等[14]2013 年采用定量 PCR,检测 GRAS 基因在低温胁迫的佛手、瓯柑、本地早、处红柚和枳，这 5 种抗寒性不同的柑橘中的表达量差异。这 5 种柑橘类植物半致死温度测定确定抗寒性强弱顺序是枳 > 本地早 > 瓯柑 > 处红柚 > 佛手，最终发现低温胁迫下 GRAS 基因在这5 种柑橘中表达量均上调，并且表达量上调的幅度大小与植株的抗寒能力的强弱呈正相关。
3 柑橘抗寒基因工程
柑橘抗寒基因工程是指将外源抗寒基因导入到柑橘细胞，并培养成整个植株的过程。近 15 年来，国内外学者发现了大量植物低温诱导基因，并逐步探明低温胁迫的分子机理，柑橘抗寒基因工程取得了巨大的进步，通过导入植物抗寒基因进而提高柑橘抗寒性的方法已成为现代柑橘育种的重要手段。
植物抗寒基因主要包括，与膜脂不饱和相关的酶基因，防止低温对细胞伤害的酶 （ SOD、脂脱氢酶）基因，抗冻及防止蛋白受冻失活的 COR 基因，抗脱水及保护胞体机能的 LEA 蛋白基因等。以下对柑橘中已有报道的抗寒基因工程途径做具体的介绍。
3. 1 鱼类抗冻基因途径
抗冻蛋白 （ AFP） 首先在鱼类中被发现，人们通过分离纯化获得高活性 AFP,并筛选、克隆抗冻基因，以期能改良其他生物的抗冻性能，已有在昆虫和鱼类中获得 AFP 基因成功转化烟草和胡萝卜的报道[32 -33].万巧兰[34]利用含 AFP 基因的根癌农杆菌菌株感染锦橙、椪柑和枳的实生苗上胚轴部分，经卡那霉素筛选出抗性芽，并微嫁接成株，最后获得 3 株转基因柑橘 （ 1 株锦橙、2 株枳） .通过 Southern 杂交和斑点杂交检测证实 AFP 基因已整合到柑橘基因组中。该研究结果初步表明，这种动物 AFP 能够在柑橘细胞中得到表达，但对柑橘抗寒性的影响尚待进一步研究。
3. 2 脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径
植物的细胞膜是整个细胞中对外界胁迫反应最大的部位，所以细胞膜的组成成分与植物的抗寒性有着密切的关系。植物受到低温胁迫时不饱和脂肪酸含量会增加，同时质膜中磷脂含量及其与蛋白质的比值也会发生改变。有研究发现 74 种植物的抗寒性与反式单不饱和磷脂酸的含量密切相关[35],其不饱和度越高，抗寒性也就越强，因此在柑橘中导入脂肪酸去饱和酶基因，减少脂肪酸的饱和程度，能够大大提高柑橘的抗旱能力。甘霖等[36]研究证明抗寒性强的金柑和宜昌橙叶片的亚油酸、棕榈酸含量低，亚麻酸含量高，相对的脂肪酸不饱和度程度也高； 然后抗寒能力比较差的哈姆林甜橙、伏令夏橙和粗柠檬却与此相反，由此可见脂肪酸不饱和程度与质膜的相变及流动性有着密切关系。孙中海等[37]同样认为柑橘质膜的不饱和程度与抗寒性呈正相关。
通过基因工程手段改变植物膜脂脂肪酸的组成，从而提高植物抗寒性的研究已有报道[23].郭惠红等[22]将从枳中获得甘油-3-磷酸酰基转移酶（ glycerol-3-phosphat-e-acyl-transferase, GPAT ） 基因导入温州蜜柑和甜橙中，以提高这 2 个柑橘品种的抗寒性，GPAT 是磷酰甘油 PG 生成的关键酶，很大程度上决定了细胞膜 PG 的不饱和度。
3. 3 外源抗氧化酶基因途径
低温胁迫下寒敏感植物细胞膜的伤害，可能与活性氧的升高有关。细胞原本就具有抗氧化能力，能够清除活性氧和自由基，其中包括超氧化物歧化酶 （ SOD） 、过氧化物酶 （ POD） 、谷胱甘肽还原酶 （ GR） 、过氧化氢酶 （ CAT） 等。细胞的抗氧化能力与柑橘的抗寒性呈正相关，因此细胞的氧化应激机制可能是调节柑橘抗寒性的另一重要机制。
Sala 等[38]发现柑橘品种间的抗旱性能的不同主要在于 CAT,GR 对过氧化氢的清除能力不同，经低温驯化后的柑橘，体内 POD 和 SOD 活性显着增强，叶片抗寒能力也显着提高。另一方面，有研究表明低温驯化提升了柑橘细胞体内抗氧化剂的含量和抗氧化酶活性，从而提高了柑橘的抗寒性。瞿金旺[39]利用根癌农杆菌介导法，将苹果中获得的亚精胺合成酶基因 MSPDS1 转入金钱橘，设想通过基因工程技术手段来提高柑橘内源多胺的含量，从而增强金钱橘抗寒性。研究结果表明低温胁迫下转入亚精胺合成酶基因 MSPDS1 的金钱橘叶片比对照植株叶片的相对电导率低，表现出更强的抗寒性。
4 前景展望
对柑橘抗寒基因的研究其最大意义在于通过基因工程方法提高一些寒敏感柑橘的抗寒能力。目前，已从鱼类抗冻基因途径、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径、外源抗氧化酶基因途径这 3 个方面取得了一定的进展，其应用前景非常广阔[40].柑橘作为重要的经济物种，在进行抗寒育种的同时应将基因工程技术手段与遗传育种、化学调控及科学栽培方法相结合，以最终提高柑橘抗寒性，防止冷害，打破柑橘种植地域限制，提高柑橘品质和产量。
参考文献：
[1] 郭卫东，张真真，蒋小韦，等。 低温胁迫下佛手半致死温度测定和抗寒性分析 [J]. 园艺学报，2009,36 （ 1） 81 - 86.
[2] 张真真。 佛手低温胁迫相关基因的差异表达研究 [D]. 金华： 浙江师范大学，2009.
[3] Weiser C J. Cold resistance and injury in woody plants [J].Science,1970,169: 1269 - 1273.
[4] 沈漫，王明麻，黄敏仁。 植物抗寒机理研究进展 [J]. 植物学通报，1997,14 （ 2） : 1 -8.