骨血管再生成种子细胞的处理及应用综述

　　摘    要：　一直以来, 大段骨缺损的修复是骨科临床的难题之一。采用组织工程学方法, 构建搭载成血管潜能种子细胞的组织工程骨可以实现材料内部早期血管化, 为成功修复大段骨缺损提供了新思路。目前, 具有成血管潜能的种子细胞来源多样, 各具优势。共培养和预处理技术的应用实现了细胞-细胞、细胞-微环境之间有效的信息交流, 定向诱导种子细胞向内皮细胞分化;运用基因编辑及基因转染技术对种子细胞进行特定改造, 使其精确表达促血管生长因子, 达到“1+1> 2”的效果。同时, 种子细胞在定向诱导的过程中存在来源有限、耗时较长、目的蛋白表达低下等不足, 细胞-细胞、细胞-微环境之间作用的具体分子学机制尚不清楚, 经特定基因转染后的种子细胞的安全性及有效性缺乏长期观察, 仍有待于今后深入探索。

　　关键词：　组织工程; 骨缺损修复; 血管化; 种子细胞;
 

　　Abstract：　The repairment of large segment bone defect has always been one of the challenges in orthopedic clinic.Tissue engineering method is used to construct tissue engineering bone with vascular potential seed cells which can realize early vascularization within the material and provides a new idea for successful repair of this kind of bone defect. At present, the seed cells with vascular potential have various sources and advantages;The application of co-culture and pretreatment technology realizes the effective exchange of information between cell-cell and cell-microenvironment, which can induce the differentiation of seed cells to endothelial cells;The gene editing and gene transfection technology were used to modify the seed cells in order to express exactly the vascular growth factor and achieve the effect of "1 + 1 > 2". At the same time, in the process of directional induction, for seed cells there are some problems, such as limited source, time consuming, low expression of interest protein, etc. The specific molecular mechanism of cell-cell, cell-microenvironment interaction remains unclear. The safety and effectiveness of seed cells transfected with specific genes are not observed over a long period of time. All these problems remain to be explored more deeply in the future.

　　Keyword：　Tissue engineering; Bone defect repairing; Vascularization; Seed cells;

　　骨科在治疗创伤、肿瘤、感染、先天性畸形等疾病时常造成大段骨缺损, 若缺损达到骨组织自我修复极限, 称为临界骨缺损[1]。组织工程骨在修复较小尺寸骨缺损时展现出良好的应用前景, 但在修复较大骨缺损时, 因骨质内部缺乏完善的脉管系统, 机体仅能通过渗透作用为工程化骨周边提供营养物质 (葡萄糖、氨基酸等) 及氧气, 运输骨细胞、代谢废物 (乳酸、尿素等) 及二氧化碳, 常导致中心部位坏死区的形成, 限制了组织工程骨的临床应用范围[2,3]。到目前为止, 具有完整脉管系统的自体骨块仍是治疗大面积骨缺损的最佳填充材料。随着再生医学的发展, 具有成血管潜能的种子细胞作为构建组织工程骨血管网的基本要素之一, 对于实现组织工程骨成功修复大段骨缺损的意义重大, 其功能和特性也越来越受到相关领域学者的重视。目前, 国内外众多学者报道利用种子细胞实现了不同材料内部早期血管网络的形成, 但所用种子细胞的种类、诱导方法不尽相同[4,5,6,7,8]。现就目前组织工程骨血管化中种子细胞的选择、一般处理方法、存在的问题进行综述, 并对未来的发展方向作一展望。

　　1、 具有成血管潜能种子细胞的选择

　　实现组织工程骨血管化的种子细胞应具有来源广、易获得、低抗原性、高增殖力等特点。20世纪70年代, Friedenstein等[9]首次报道了骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) , 该细胞具有容易纯化、体外培养要求低、低抗原性、扩增迅速等优势。王志红等[10]通过建立小鼠皮肤缺血模型研究BMSCs对缺血组织的修复作用发现, 皮下注射BMSCs组小鼠皮肤缺血状态明显改善, 免疫蛋白印迹法显示Wnt/β联蛋白 (β-catenin) 信号通路上游激活蛋白Wnt1和β-catenin在损伤部位高表达。国外研究也证实, 经典Wnt信号通路在促进新骨生成和血管新生方面发挥重要作用[11]。

　　BMSCs发现较早, 具有干细胞的一般特征, 但有研究报道体内BMSCs储量相对较低, 不能满足临床应用的需求[7]。随后人们发现了脂肪干细胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) , 与BMSCs不同, 脂肪组织中ADSCs的浓度是骨髓中BMSCs浓度的100~300倍, 丰富的来源使之成为近年来干细胞研究的热点[12]。已有研究证实, ADSCs在一定诱导条件下能分泌碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 、血小板源性生长因子、基质细胞衍生因子1等活性成分, 参与组织器官的发育、促进血管形成、支持造血、抗凋亡及加速细胞增殖[13,14]。

　　随着干细胞研究的深入, 人们从牙髓组织中成功分离出牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 。为检验DPSCs的血管生成能力, Marchionni等[4]向培养基中添加VEGF, 7 d后透射电镜观察到新生细胞内出现了常存在于内皮细胞胞质中的胞饮小泡, 基质胶中培养形成了大量类似原始毛细血管样结构;流式细胞术检测发现VEGF受体 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 、细胞间黏附分子1和血管性血友病因子 (von willebrand factor, vWF) 等内皮细胞标记表达于细胞表面。Alge等[15]将BMSCs和DPSCs进行比较发现, DPSCs表现出更短的倍增时间和更高的矿化活性, 提示DPSCs在诱导成骨成血管方面具有独特的优势和前景。国内外学者对内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells, EPCs) 、羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、尿源性干细胞等不同来源的种子细胞展开研究, 通过一定方法诱导, 证实其均可向血管样结构分化[16,17,18,19,20]。

　　2、 种子细胞的一般处理方法

　　2.1、 共培养

　　血管生成是一个极其复杂的过程, 需要细胞和生长因子的共同参与。细胞间通过缝隙连接实现信息的有效传递, 通过旁分泌促进自身及周边细胞的更新和定向分化[13,21]。为模拟微环境下细胞与细胞、细胞与外基质间的相互作用, 提高细胞定向诱导能力, 共培养技术得到广泛应用。有研究表明, 共培养条件下, ADSCs通过缝隙连接与内皮细胞交换调节信号, 提高了微脉管形成率[22]。Deveza等[23]发现, 单纯利用间充质干细胞 (mesenchyma stem cells, MSCs) 培养过程中产生的上清液就可以发挥促进内皮细胞存活和迁移的作用, 在培养过程中MSCs通过旁分泌作用向基质中释放某些信号分子或生长因子, 进而造成内皮细胞生物学行为的改变。利用共培养的优势, Kang等[5]将人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 接种到预先培养的人MSCs薄片上, 然后将其包裹于β-磷酸三钙支架表面, 制成含“骨膜”结构的人工骨, 体外培养3 d可见支架表面形成毛细管网状结构;将支架移植入裸鼠背部皮下, 8周后可见支架血管与宿主血管广泛连通, 支架骨化程度也显着提高。关于MSCs与HUVECs共培养条件下促进成骨成血管的机制, 刘春晓等[24]认为, 在此条件下MSCs通过旁分泌产生的VEGF作用于内皮细胞, 提高了内皮细胞的增殖和血管形成效应, 同时MSCs可诱导内皮细胞产生骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2) , 促进自身向成骨细胞转化。Paul等[25]认为由血管新生活性因子Slit3和血管内皮细胞跨膜蛋白受体Robo4共同组成的Slit3-Robo4信号通路在MSCs与HUVECs的相互作用中起到关键作用。

　　2.2、 预处理

　　细胞处在动态变化的微环境中, 理化因素共同参与其生物学行为的调节。细胞接受应力刺激, 通过微丝微管传递给细胞核, 导致核内特定基因的表达增强, 并在此过程中产生一系列生化反应。有文献报道, EPCs在血流剪切力的持续作用下可向内皮样细胞分化[26]。Melchiorri等[6]为进一步探究EPCs在外力作用下的生物学改变, 将预先制作的接种有EPCs的己内酯丙交酯血管模型连接于可模拟人体血流的体外三维灌注系统, 分别于3、7、14 d检测细胞表面标志物表达情况, 可见动态环境下培养的EPCs增殖较静态培养更为明显, 原始细胞标志物CD34表达低于静态培养组, 而成熟内皮细胞标志物CD31、vWF的表达高于同时期静态培养组, 实验表明, 持续流体灌注的动态培养条件加速了EPCs的增殖并向功能性内皮细胞的定向分化。Steward等[27]将MSCs与内皮细胞按照1∶1的比例共培养于成骨-成血管诱导培养基, 利用Flexcell细胞组织力学培养系统产生10%的循环拉伸外力, 观察到在应力条件下共培养组矿物质沉积较对照组 (未施加应力或未共培养组) 明显增多, 但研究未发现内皮细胞标志物CD31、血管内皮钙黏蛋白有明显变化。尽管未检测到明显的血管形成, 但研究认为, 持续的拉伸外力增强了MSCs产生VEGF的能力, 进而使内皮细胞中BMP-2基因表达增强, 促进了成骨作用。

　　人体骨髓腔为相对低氧环境, 组织工程骨支架植入缺损部位后在其中心部位也常呈持续低氧状态[2]。有研究报道, 适度的低氧环境可引发缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1) 信号级联反应, 通过下游蛋白的激活提高自身耐受能力和血管生成作用[28]。Liu等[7]为探究培养环境对干细胞表达VEGF和bFGF的影响, 采取低氧预处理ADSCs发现, VEGF和bFGF表达量高于对照组 (正常氧浓度组) , 实验进一步将HUVECs加入细胞上清液, 发现其在基质上形成的毛细血管样结构显着多于对照组。陈铁龙[29]将骨髓基质细胞在0.5%氧浓度下培养, 24 h后注射入心肌梗死动物模型心肌坏死区发现, 移植后24 h内经低氧预处理的MSC死亡率为70%, 而未经处理的MSC死亡率达到90%;且移植6周后发现, 低氧预处理组心肌梗死面积小于未处理组。王苹苹等[30]研究认为, HIF-1在低氧条件下维持MSCs的存活中起到关键作用。低氧条件下, HIF-1可介导细胞非氧化代谢途径, 通过激活丙酮酸脱氢酶激酶 (pyruvate dehydrogenase kinase, PDK) 1编码的PDK蛋白, 抑制三羧酸循环中乙酰辅酶A的合成, 从而降低细胞氧气消耗, 以利于细胞在低氧条件下存活。同时, 低氧状态可刺激MSCs上调VEGF的基因表达, 促进血管生长因子的释放。

　　2.3、基因编辑与基因转染

　　基因编辑技术对特定DNA片段进行剔除或加入, 实现对目的基因的改造。基因转染技术是将某一遗传信息通过一定方法传递到受体细胞, 使受体细胞稳定表达该遗传信息。通过对特定遗传信息的编辑修饰, 运用基因转染方法实现对细胞的定向改造。Morita等[31]通过对内皮发育和血管发育重要的18个转录因子进行筛选发现, E-26转录因子 (E-twenty six, Ets) 家族中名为Ets变体2 (Ets variant 2, ETV2) 的转录因子可将原始的人皮肤成纤维细胞转化成为功能性的血管内皮细胞。Pham等[8]利用编码ETV2转录因子的信使RNA直接转染表皮成纤维细胞, 低氧条件下培育14 d后检测发现, 部分细胞表达与EPCs的表面标志物CD31和VEGFR类似, 小管形成实验显示其可在基质胶中形成与HUVECs相似的管样结构。随后, 将这些细胞注入下肢缺血小鼠模型, 发现实验组小鼠肢体坏死程度、血流恢复情况及治愈率均高于对照组, 经信使RNA转染后的表皮成纤维细胞成功转化为EPCs, 同时低氧条件提高了成纤维细胞的转化率。通过基因转染方法改造细胞, 对弥补种子细胞在血管化过程中来源不足、培养效率低下等问题具有重要意义。

　　缺血部位促血管生成因子 (如VEGF) 的释放与浓度的升高具有明确的时间窗, 较低剂量表达无效, 而较高剂量表达常引起异常的血管生长[32]。有研究认为, 达到新生血管成熟稳定的促血管生长因子的表达至少需持续4周[33]。为解决缺血部位生长因子量不足及作用时间过短的问题, Spanholtz等[34]利用腺病毒载体搭载VEGF165和bFGF基因成功转染成纤维细胞, 实现体内对VEGF和bFGF的持续活性递送, 使VEGF持续高水平表达。有文献报道, 病理状态下VEGF蛋白持续升高可导致局部血管瘤形成[35]。为达到对生长因子释放量及释放时间的有效调控, Song等[36]利用基因编辑技术构建上游含9个串联状缺氧应答元件 (hypoxia response element, HRE) 和猿猴空泡病毒40的启动子, 下游含编码人VEGF基因序列的片段, 采用基因转染技术成功将目的基因导入受体细胞。在缺氧条件下, 局部组织细胞合成的HIF-1蛋白与启动子和增强子中HRE结合, 启动并增强下游VEGF基因的转录, 使VEGF合成增加;在正常氧浓度条件下, 合成的大部分HIF-1被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解, 无法与含HRE的启动子结合而启动转录, 使VEGF合成减少。该方法有效避免了重组细胞局部持续合成释放促血管生长因子的问题。

　　3、 种子细胞应用过程中面临的问题

　　通过上述不同方法定向诱导改造种子细胞, 可以为组织工程骨内部早期血管化提供条件, 但同时在应用过程中仍存在一些亟待解决的问题: (1) 目前各类型干细胞分选、鉴定、体外培养缺乏统一标准, 干细胞在移植后是否存在致瘤作用尚存争议[37]。有研究表明, 长期体外扩增干细胞、祖细胞等较低水平分化细胞可引起基因组不稳定和染色体畸变, 部分学者建议通过减少增殖量及传代次数降低染色体畸变的风险[38,39]。 (2) 有研究报道, 共培养外周血来源的EPCs和MSCs复合掺锶聚磷酸钙多孔支架可实现良好的组织工程骨预血管化[40]。但有学者将MSCs单独或与EPCs共同搭载于含可缓释VEGF的聚乳酸-羟基乙酸微球的β-磷酸三钙支架上, 8周后检测发现, 共培养组支架中新生骨量少于MSCs组, 认为在构建组织工程骨支架修复骨缺损中加入EPCs的共培养是非必需的, 提示不同细胞在共培养过程中的相互作用原理尚需深入研究[41]。 (3) 经基因转染后重组细胞的有效性、稳定性及安全性缺乏长期观察。同时, 经腺病毒转染宿主细胞存在转染效率低下, 宿主细胞死亡率过高, 转染后目标蛋白表达不足等问题[34,42]。通过荧光激活细胞分选技术, 可纯化稳定转染的种子细胞, 以提高递送细胞因子的有效性和安全性。然而, 该方法耗费时间仍较长, 且需要体外大量扩增才能达到所需数量的细胞。

　　4、 小结

　　自1909年Maksimov首次发现造血干细胞以来, 对于干细胞的研究从未停止[43]。BMSCs、ADSCs、DPSCs等的陆续发现极大地丰富了组织工程骨血管化种子细胞的来源。利用不同种类干细胞的独特优势, 构建共培养体系, 采用低氧预处理、动态预处理、基因编辑与基因转染技术, 实现对构建组织工程骨血管化种子细胞的多角度优化。但是, 种子细胞来源有限, 分离和提取缺乏国际标准, 定向诱导过程中的安全性和有效性也存在争议。未来组织工程学针对种子细胞的研究应在探索不同细胞生物学行为异同的基础上优化种子细胞的培养体系, 深入研究细胞-细胞、细胞-微环境、细胞-支架间的相互作用机制, 从而精准把握不同信号途径对种子细胞生物行为的影响。通过技术革新, 提高种子细胞的转染效率及成活率, 高效便捷地筛选符合条件的种子细胞, 也将成为未来研究的另一热点。总而言之, 种子细胞作为组织工程学三要素之一, 具有基础而重要的地位。随着研究的深入, 利用成血管潜能种子细胞实现组织工程骨内部早期血管化将具有独特优势和广阔的前景。

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