骨组织工程理想支架的搭建及其性能分析

　　慢性骨髓炎骨缺损的治疗一直是困扰骨科医生的难题之一[1-2].骨组织工程学研究的进步为慢性骨髓炎骨缺损的治疗带来了新思路、新方法，通过将细胞因子复合生物支架材料修复骨缺损载药组织工程支架已成为骨组织工程学研究的热点[3].本实验使用聚乳酸（polylactic acid,PLA）为缓释载体，采用复乳溶剂挥发法成功制备出的重组人骨形态发生蛋白 2（recombinant humanbone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）/PLA 缓 释 微 球和万古霉素/PLA 缓释微球，并整合到纳米羟基磷灰石/壳聚糖（n-HA/CS）生物支架中，对其生物性能进行研究。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料 纳米羟基磷灰石、壳聚糖（山东潍坊市海之源生物公司）；万古霉素（韩国希杰有限公司）；冷冻干燥机（美国 Thermo 公司）；S-3400N 扫描电镜（日立公司）；rhBMP-2（上海生工生物工程有限公司）；ATCC29210 金黄色葡萄球菌由遵义市第一人民医院检验科惠赠。

　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 rhBMP-2/PLA 和万古霉素/PLA 缓释微球 n-HA/CS生物支架的制备 根据 Ma 等[4]

　　等方法将壳聚糖溶液、纳米羟基磷灰石适当比例混合，倒入准备好的铸模槽，通过冻干技术与化学交联方法制备成固体材料，并进入含有rhBMP-2/PLA 和万古霉素/PLA 缓释微球溶液中，-80 ℃冷冻 2 h 后放入真空冷冻干燥机内干燥 12 h,用60Co 辐照消毒备用。

　　1.2.2 载药组织工程支架的性能测定 采用扫描电镜检测观察空隙形貌，用万能材料试验机检测支架材料的抗压能力，观察是否符合实验要求。将制备成功的固体材料放置 4 ℃冰箱保存。

　　1.2.3 载药组织工程支架的体外抑菌实验 将支架材料置于接种金黄色葡萄球菌的琼脂固体培养基中，37 ℃恒温培养箱培养 24 h,用卡尺测量抑菌的范围，取出支架材料重新置于接种金黄色葡萄球菌的琼脂固体培养基中。以后每 2 天测量 1 次抑菌范围并更换培养基，直至不再出现抑菌圈。

　　1.2.4 缓释微球万古霉素及 rhBMP-2 释放效率的测定 称取 10 mg rhBMP-2/PLA 和万古霉素缓释微球溶于适量双蒸水，每隔 2 d 用 ELISA 法测定溶液中 rhBMP-2和万古霉素的浓度，并每 2 天移去原溶液 50%溶液，并用无菌 PBS 补充至原量。根据测定值绘制释放曲线。

　　2 结 果
　　
　　2.1 支架材料的电镜扫描及生物力学测试 支架材料经电镜扫描后呈现出丰富的不规则多孔结构，各孔之间相通性好，孔径大小为 80~270 μm,平均孔径为146.53 μm.见图 1.
　　
　　2.2 缓释微球整合情况观察 扫描电镜下观察发现，rhBMP-2/PLA 和万古霉素/PLA 缓释微球均匀紧密地黏附在 n-HA/CS 支架的孔隙中，部分缓释微球成团状分布。见图 2.
　　
　　2.3 载药支架材料的体外抑菌性能 载药材料在体外能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，其抑菌作用持续25 d;随着时间推移，抑菌范围不断缩小。见图 3.

　　2.4 万古霉素/PLA、rhBMP-2/PLA 释放效率 万古霉素/PLA 和 rhBMP-2/PLA 均可持续缓慢释放，其持续时间可达 18 d,随着时间的延长释放量逐步下降。见图 4.
　　
　　3 讨 论
　　
　　慢性骨髓炎的治疗是骨科疾病的难题。近年来，随着抗生素的不断升级及骨科诊疗技术的不断进步，临床对骨髓炎的治愈率不断提高，但治疗效果仍不理想。目前慢性骨髓炎的治疗主要包括彻底清创、持续冲洗及抗生素的应用[5].抗生素的长期应用存在多种不良反应，如胃肠道反应、耳毒性、肾毒性及骨髓抑制等。研究表明，局部应用抗生素可达到有效浓度并减轻不良反应。最早应用于临床的载药植入材料是一种聚甲基丙烯酸甲酯，其植入体内后会放热，单体成分对人体具有毒性，组织相容性差，需二次手术取出，患者创伤及经济负担重，限制了其临床应用[6-7].因此，研发新的局部抗生素缓释系统，可为慢性骨髓炎提供新的治疗方案。

　　作为骨组织工程理想支架材料应当具有很好的生物相容性、可降解性及适宜的机械强度等。壳聚糖、羟基磷灰石均为天然材料，具有良好的生物相容性，但单独应用制成支架均存在一定的缺陷。叶鹏等[8]将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石通过冷冻干燥法与化学交联技术制备成生物支架，其相关检测达到骨组织工程支架的基本要求。rhBMP-2 是经实验证实的最重要的骨诱导因子，是控制骨缺损修复信号通路的必需成分，是目前骨组织工程研究最多和应用最广泛的生长因子[9-10].

　　但因其半衰期短，在局部组织中易被降解或在体液中快速扩散，难以在骨缺损部位持续诱导成骨[11].因此，构建能够持续释放 rhBMP-2 的缓释系统对骨缺损修复具有重要意义。【图略】