低温保护剂渗透关节软骨的实验研究和数学建模

　　引言

　　玻璃化保存生物材料可以避免冰晶形成带来的直接危害（ 如细胞膜破裂） 和间接危害（ 如电解质浓缩导致蛋白质变性） ,是低温保存生物材料、建立生物样品库的理想选择。关节软骨的玻璃化保存研究具有两个方面的重要意义： 一是软骨移植是临床上修复、重建和替换受损关节软骨的有效手段。

　　捐献的软骨若能长期保存，那么外科医生将可针对病变部位挑选合适的移植物，并且有充裕的时间进行多项检测，以防止供者可能带来的病毒或细菌感染。这不仅有助于提高软骨移植手术的成功率，而且使得软骨移植手术的广泛开展成为可能。二是关节软骨仅由单一的软骨细胞和软骨基质构成，不含血管、神经和淋巴管，被认为是研究生物组织玻璃化保存的理想对象。关节软骨的成功保存对低温保存从细胞水平跨越到体积更大、结构更复杂的组织层面具有重要意义。

　　Song 等最早报道了玻璃化保存关节软骨的较为成功的案例---采用玻璃化溶液 VS55（ 含二甲亚砜、甲酰胺和丙二醇，55 表示低温保护剂总浓度，单位%（ W/V） ） 以及特定的步骤，对较薄的兔关节软骨实施了玻璃化保存并进行移植试验[1].Pegg 等提出了一边降低温度、一边提高低温保护剂浓度并始终使温度略高于组织冻结点的新方法（ liquidus-tracking method） 来实现玻璃化[2].该方法的最大优点是不需要快速冷却和升温，不足是低温保护剂溶液处理软骨样品的时间很长，且操作步骤繁琐。

　　Pegg 等也曾尝试 Song 等的保存方案，但发现某些技术环节难以复制。Guan 等尝试将经过 VS55 处理的牛关节软骨直接投入液氮，发现快速冷却对保护软骨细胞及软骨基质具有积极作用，但方案的诸多环节有待优化[3].Brockbank 等比较了 VS55 和 VS83玻璃化保存猪关节软骨的效果，发现在相同保存步骤下浓度较高的 VS83 更适合较厚的猪关节软骨，但如此高浓度的 VS83 溶液的毒性不可忽视[4].Jomha 等对影响玻璃化保存的多个因素进行研究，从而优化保存方案，对人关节软骨进行了较为成功的玻璃化保存---软骨细胞存活率约 75%,可基本满足临床移植要求，但仍待进一步提高[5].国内的胥义等则采用动态热机械分析法，研究关节软骨力学性能的低温损伤机理，为关节软骨保存方案的优化提供力学依据[6 -8].尽管目前对关节软骨玻璃化保存的研究已有了相当多的成果，但如上所述，保存方案大多或多或少地存在这样或那样的缺陷与不足。为了完善关节软骨玻璃化保存技术，相关的基础问题仍需要深入研究[9].玻璃化保存关节软骨的一般流程如图 1 所示，其中的关键是： 在保证对软骨细胞造成的损伤最小的前提下，将足够多的低温保护剂载入软骨组织，以避免在后续的冷却和升温步骤中形成冰晶。低温保护剂虽能在低温下对软骨细胞起保护作用，但却极易在加载处理过程中对软骨细胞造成毒性损伤，这种毒性损伤与低温保护剂的种类、浓度、加载处理温度和时间均密切相关[10 -11].因此，深入了解低温保护剂渗透（ permeate） 关节软骨的特性，对合理设计加载处理程序非常重要。笔者对低温保护剂渗透关节软骨过程的实验研究和数学建模两方面的进展进行了较为详细的评述，并对今后的研究方向提出了展望。
　　
　　1 实验研究

　　根据所采用的低温保护剂定量分析方法的不同，实验研究低温保护剂渗透关节软骨一般可采用两种路线，如图 2 所示[12].实验步骤大致如下： 首先是采用合适的工具（ 如角膜环转） ,在关节的负重部位获取所需大小的软骨样品，用缓冲溶液（ 如PBS） 漂洗并擦干后，将其置于事先配制好的一定温度和浓度的低温保护剂溶液中浸渗处理指定的时间。一种路线，如果是对低温保护剂进行组织原位定量分析（ 如采用磁共振成像（ MRI） ） ,则将浸渗处理过的软骨样品快速漂洗并擦干，再放于相应仪器中测量（ 图 2 中路线 2） ; 另一种路线，将浸渗处理过的软骨样品快速漂洗并擦干，然后置于一定量的纯水中并放置足够长的时间，使得其中的低温保护剂可以充分反渗出来，再采用合适的方法（ 比如高效液相色谱（ HPLC） ） ,对所得反渗液中的低温保护剂进行定量分析（ 图 2 中路线 1） .如此重复，不管选用哪种路线，最终都可以得到渗入软骨样品的低温保护剂的量随时间的变化关系。实验采用的软骨样品可以是不带软骨下骨（ subchondral bone） 的软骨片（ cartilage disc） ,也可以是带软骨下骨的骨软骨栓（ osteochondral dowel） .已有研究表明，低温保护剂在这两种样品中的扩散特性并无显着差别.到目前为止，研究者已经提出和采用多种不同的低温保护剂定量分析方法，研究了低温保护剂渗透关 节 软 骨 的 过 程。在 路 线 1 中，核 磁 共 振（ NMR）[15 -17]和高效液相色谱（ HPLC）[18]是经常采用的低温保护剂定量分析方法； 而路线 2 中的典型定量手段是磁共振成像（ MRI） ,如 Carsi 等采用 MRI分别研究了二甲亚砜和甘油在人关节软骨中的扩散[19].MRI 技术可以对软骨样品中的低温保护剂进行组织原位定量分析，不仅可以获得一个总的浓度，还可以知道低温保护剂在组织中的空间分布情况，并进而获取软骨组织的各向异性对扩散的影响信息。Abazari 等就采用 MRI 技术，首次实验得到了二甲亚砜在猪骨软骨栓中的时空分布情况。他们的数据表明，软骨组织的各向异性对二甲亚砜扩散的影响很小，且二甲亚砜无法从软骨样品的骨侧渗入[20].不管是 MRI 还是 NMR 或 HPLC,均存在所需设备昂贵、操作复杂的缺点。于是，有研究者提出了渗透压仪法，即采用渗透压仪测得反渗液的质量渗摩尔浓度（ osmolality,是指在 1kg 溶剂中所溶解的具有渗透作用的微粒的量，单位为 Osm·kg- 1或osmol·kg- 1） ,再经过换算以得到所要的浓度。

　　Sharma 等[11]和 Jomha 等[21]分别采用该方法，得到了二甲亚砜、丙二醇、乙二醇和甘油渗入猪软骨样品的量随时间的变化数据。有研究者也通过测量洗脱液的质量渗摩尔浓度，确定除去软骨样品中的低温保护剂所需的时间[22].笔者所在研究小组也采用渗透压仪法，实验研究了二甲亚砜对羊关节软骨的渗透性[23].另外，还依据二甲亚砜分子的特性---含有亚砜基团（ - SO - ） 这一硫基生色团，提出可采用紫外吸收光谱法对反渗液中的二甲亚砜进行定量[24].

　　低温保护剂对生物材料的毒性是与温度密切相关的---温度越低，毒性越小。Pegg 等提出一边降低温度、一边提高二甲亚砜浓度并始终使温度略高于组织冻结点的方法，在玻璃化保存羊关节软骨上获得了较大成功[2].借鉴 Pegg 等的这一思想，Jomha 等在对影响玻璃化保存的多个因素进行优化的基础上，实施了较为成功的人关节软骨玻璃化保存[5].实践证明，边降温、边提高低温保护剂浓度的方法是行之有效的，但要在加载低温保护剂时加以贯彻，则低温保护剂在宽温度范围内对软骨样品的渗透性数据必不可少。然而，目前研究者对低温保护剂渗透关节软骨过程的研究大都局限于 0℃以上温区[15 -23],一方面可能是 0℃以下温区渗透实验操作上的困难，另一方面可能是大多数研究者仍习惯尝试采用传统的玻璃化法（ 见图 1） 来保存关节软骨。鉴于此，笔者所在的研究小组设计并搭建了专门的实验装置（ 见图 3） ,首次研究了 - 10、- 20 和- 30℃ 时二甲亚砜渗透羊软骨样品的过程，并结合Fick 扩散定律拟合得了相应的扩散系数数据[21].有关该实验装置的详细介绍可参见文献[9,25 -26].