心肌损伤血液生化标志物检测中微流控芯片的运用

　　1 引 言

　　急性心肌梗死（ Acute myocardial infarction,AMI） 、慢性心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病是严重危害人类健康的常见疾病。实现快速的早期诊断和有效治疗干预，对挽救心血管疾病患者的生命具有重要意义。随着临床检验技术的进展，心肌损伤的血液生化标志物，从以检测酶活力为主的肌酸激酶等酶学检验，发展到以检测蛋白质为主的多种心肌损伤标志物，诊断价值逐渐提高。目前，这些具有高度特异性和敏感性的心肌损伤标志物检测指标普遍应用于临床实验室诊断，为心血管疾病的临床准确诊断、鉴别诊断和判断治疗效果提供重要依据。

　　现阶段，针对心肌损伤标志物分析检测的主要方式是基于抗原抗体的免疫反应，其优势在于免疫分析具有较高的选择性和灵敏度，但常规方法也存在着检测时间周期长等局限。研究显示，AMI 发病 3 h是挽救濒死心肌梗死病人的“黄金”时间，若发病 6 h 后才得到救治，死亡率将增加 10% ~12%[1].至今，检测方法的局限性、基层医院的现状、糖尿病并发症以及患者的自我防护意识欠缺等因素是我国心血管疾病患者发病率居高不下的重要原因。因此，迫切需求发展建立适于快速、简便的高敏感性心肌损伤标志物的方法，为快速早期诊断和心肌梗塞等心血管疾病有效预防提供重要手段。

　　微流控芯片是近年发展起来的一种新兴技术，具有微尺度液体流动可控、低试剂消耗、分析速度快、多功能集成和高通量等独特优势，已经在生命科学的多个领域显示出应用前景，包括快速生物分析[2 ~6],生化检验[7,8],病原体检测[9]等。本文着重介绍近年来微流控芯片在心肌损伤标志物检测方面的应用进展，以期为重大疾病监测和快速医学检验提供一种重要潜在平台。

　　2 心肌标志物概述

　　心肌损伤标志物主要有心肌肌钙蛋白 T（ Troponin T,cTnT） 、心肌肌钙蛋白 I（ Troponin I,cTnI） 、肌红蛋白（ Myoglobin,Myo） 、肌酸激酶同工酶（ Creatine kinase isoenzyme,CK-MB） 、B 型尿钠肽（ B-type na-triuretic peptide,BNP） 和超敏 C 反应蛋白（ C-reactive protein,CRP） 等。对于隐匿性的心血管疾病，血清中有关标志物的动态变化则具有特殊价值。心肌损伤的早期标志物主要有 CRP、Myo 和 BNP,在心肌损伤的早期即可出现异常增高。CRP 是肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，其异常增高反应动脉本身内在性炎症和组织损伤与 AMI 梗死面积的大小有关[10].Myo 在心肌细胞质含量丰富，AMI 发作 1 ~2 h 后，心肌受到受损，Myo 能够更加迅速地释放到血液循环中，其浓度在 6 ~ 9 h 后达到峰值，是 AMI 诊断的早期最灵敏的指标[11].BNP 是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，当心肌细胞受到刺激，BNP 快速合成并释放入血液中，在心力衰竭的早期诊断、监测病程进展等方面有重要的临床意义。

　　虽然 CRP,Myo 和 BNP 在心肌细胞损伤早期有较高的灵敏度，但三者在辅助心血管疾病诊断时缺乏特异性。CRP 是血管炎症的标志物，在炎症、创伤和肿瘤浸润时其血清浓度都会显着升高。Myo 同样存在于骨骼肌中，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高。升高的血浆 BNP 浓度也并不一定由心力衰竭引起，某些心脏病、肾功能衰竭、肝硬化等也可使血浆 BNP 浓度升高。所以 CRP、Myo和 BNP 对冠状动脉综合征、心力衰竭及 AMI 具有较重要的危险性预测和辅助诊断价值，但不具有确诊价值，还需要结合特异性高的心肌损伤标志物监测，如心肌酶谱中的 CK-MB 和心肌肌钙蛋白 cTn.

　　CK-MB 主要存在于心肌中，对判断心肌损伤具有高度特异性。正常人血清中 CK-MB 含量极少（ 低于总活性 5%） ,当心肌受损时释放入血。AMI 发病后 3 ~8 h,CK-MB 即开始升高，在发病 12 ~24 h 达到峰值。在无 AMI 并发症情况下，CK-MB 浓度 3 d 后恢复至正常，而在有 AMI 梗死的情况下，CK-MB浓度则一直保持高浓度值。CK-MB 的检测，对判定 AMI 梗死发生的时间、面积、部位、梗死的扩展及有无心肌灌注均具有一定的价值[10].心肌肌钙蛋白是存在于心肌内的蛋白质，根据结构和功能不同可划分为 3 种亚型，即 cTnT,cTnC 和 cTnI.其中 cTnT 和 cTnI 只存在心肌组织中，故在临床广泛用于检测心肌损伤。由于 cTnI 对心肌损伤的特异性极高，且仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，是心肌损伤的特异标志物，一旦检测到 cTnI,即表明病人已出现不可逆的心肌损害，不会因骨骼肌或其它组织的损害而出现假阳性[9].总体而言，联合检测心肌酶谱、Myo,cTnI 及 CRP 对诊断心血管疾病、疗效观察及预后判断等将具有重要的临床价值，能为临床医师及时抢救和诊治病人提供快捷有效的依据。

　　3 微流控芯片心肌标志物检测原理

　　目前，利用微流控芯片进行心肌标志物检测大多依赖芯片上的免疫分析原理，即将微流控芯片与常规的免疫分析方法相结合，通过芯片微尺度通道的流体控制和抗原抗体反应来完成快速的免疫反应。

　　以芯片为载体的免疫分析具有试剂耗量少、分析时间短、易于集成、自动化等特点。目前，微流控免疫分析芯片材料主要以单晶硅片、玻璃、石英和有机聚合物材料及纸基材料等为主。根据作用介质的均一性，芯片免疫分析包括两种基本类型，均相免疫分析和非均相免疫分析。

　　3. 1 均相微流控免疫分析

　　均相微流控免疫是指免疫试剂和底物在微流控系统同一液相介质中进行的抗原-抗体复合物形成、实时分离检测的分析方法。该方法集成了微流控芯片多路流体控制与芯片快速电泳分离特点，可实现对抗原-抗体复合物的同步化快速分离及检测。Koutny 等[13]建立了血清中可的松的免疫测定方法，利用电动力驱动液流，实现芯片外抗原-抗体复合物与游离的抗原、抗体的分离，因此仅为部分意义上的微流控芯片免疫分析。Wang 等[14]在玻璃芯片上先进行抗原、酶标记抗体混合反应，然后经电泳分离后，在分离通道下游电化学检测鼠免疫球蛋白。均相微流控免疫分析节省了抗体固定和洗涤等步骤，且液流操作方便，有利于实现多种心肌标志物的并行检测和集成分析。

　　3. 2 非均相微流控免疫分析

　　与均相微流控免疫分析相比，非均相微流控免疫则是将抗原（ 或抗体） 固定在微流控芯片固相载体表面，经过特异性免疫反应，目标抗体（ 或抗原） 结合在固相载体表面即形成抗原-抗体复合物。由于在不同介质中形成抗原-抗体复合物，一般通过常规清洗可完成抗原-抗体复合物与游离抗原抗体的分离。

　　非均相微流控免疫方法可以用于心肌标志物的分析检测，其中用于抗原（ 或抗体） 固定的固相载体种类较多，包括芯片通道表面[15 ~17]、微珠[18 ~20]、电极表面[21,22]及多聚物薄膜材料[23,24]等。本研究组以具有蛋白吸附功能的聚二甲基硅氧烷、纸基材料及玻璃通道表面为固定载体进行酶联免疫分析，建立了一系列基于多通道的人免疫球蛋白 G 酶联免疫吸附反应检测体系[8,25,26].相对于均相微流控免疫分析，非均相微流控免疫分析速度更快，抗体消耗量更少，也更有利于实现阵列式、集成化的心肌标志物检测。但是由于该方式包含第二抗体的反应步骤和多步洗涤过程，增加了微流控芯片的操作流程，对实际操作提出了较高要求。

　　4 微流控芯片心肌标志物检测方法

　　以微流控芯片为平台的心肌标志物免疫分析通常发生在微米尺寸的微结构中，因此对检测方法的要求比传统免疫检验更为严格。与之相匹配，需要发展灵敏度高、响应速度快、微型化和集成化的检测方法。电化学检测法和光学检测法是目前最常用的检测方式（ 表 1） .

　　4. 1 电化学检测

　　电化学检测是通过电极将反应液中与待测物含量相关的化学信号转化为电信号，从而实现对待测物组分检测的一种分析方法。电化学检测的主要优势是灵敏度高、选择性好、装置简单且体积小。随着微电极加工技术的发展，研究者经常采用一些特殊技术结合电化学检测方法来达到痕量检测。Wang等[24]利用自组装单层膜技术结合电化学检测方法，通过检测电势变化而测定样本中的 Myo 和血红蛋白。Zhou 等[27]利用量子点标记抗体结合方波溶出伏安法（ Sequare wave stripping voltammetry,SWASV）同时检测了两种心肌标志物 cTnI 和 CRP.当 cTnI 和 CRP 分别在 0. 01 ~50 μg/L 和 0. 5 ~200 μg/L范围内时，检测电流与检测物浓度具有较好的线性一致性。Abad 等[21]加工了具有多个电极的环丙烯聚合物微流控芯片，可同时独立检测 6 个样本，检出限分别达 0. 017 ng/mL,灵敏度大大超过传统手段。

　　电化学检测技术与微流控芯片相结合，将进一步减少待测样本消耗量，缩短分析时间，增加反应灵敏度，易于发展成为潜在的心肌标志物即时诊断平台。此外，为克服心肌标志物检测需要辅助昂贵检测设备的限制，近年来，研究者开发了一些轻便、成本低、实用性广，并可定量的检测装置。Wang 等[22]将能识别 Myo 抗原的 DNA 适配体片段与能催化并将蔗糖转化成葡萄糖的转化酶结合，形成功能化的 DNA 传感器。使用者可以用血糖仪量化血液样本中Myo 的含量，检出限达 50 pmol / L.转盘式离心微流控技术是另一种新型免疫分析方式。Kim 等[20]

　　以聚碳酸酯为芯片材料，制成仅靠离心力驱动样本的微流控磁盘，将 CRP 抗体修饰的聚苯乙烯微球预封闭在磁盘的一个微池内，通过离心捕获样本中抗原，利用安培法检测 CRP 浓度，检出限达 4. 9 pg/mL（ 图 1） .这些低成本技术的引入将有利于进一步降低检测成本，尤其对偏远地区医疗资源相对缺乏的诊断需求更有意义。