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可检测CYP2C19基因多态性的PCR-荧光探针法

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2015-12-21 共4497字
摘要

  细 胞 色 素 P450 ( cytochrome P450,简 称 为CYP450) 酶系是药物在体内的主要代谢酶系。其中CYP2C19 酶又称为 S - 美芬妥英 - 4 - 羟化酶,是CYP450 家族中最重要的药物代谢酶之一,其遗传多态性影响着氯吡格雷、奥美拉唑、苯妥英钠和地西泮等许多药物的代谢[1].人类 CYP2C19 基因定位于 10q24. 1-24. 3,野生型为 CYP2C19* 1/* 1 型。

  但中国人群中常有基因突变,常见突变类型是CYP2C19* 2 型( 第 5 外显子 G681A) 和 CYP2C19*3 型( 第 4 外显子 G636A)[2].CYP2C19* 2 型和CYP2C19* 3 型可引起 CYP2C19 基因编码的酶活性丧失,代谢底物的能力减弱,使血药浓度增高,在常规治疗剂量时易引起蓄积中毒[3].中国人群中的弱代谢者 99%为 CYP2C19* 2 型和 CYP2C19* 3型等位基因。2006 年 Sim 等[4]发现了一种新的CYP2C19 等位基因 CYP2C19* 17,带有的突变位点是: – 806C > T.CYP2C19* 17 等位基因在人群中也有较高的频率出现,CYP2C19 * 17 型则引起CYP2C19 基因编码的酶活性增强,代谢底物的能力增强[5],因此需要增加药物剂量。

  目前临床或实验室检测 CYP2C19 基因多态性的方法很多,包括测序法、基因芯片法[6 -7]和荧光定量 PCR 法[8 -9]等。本研究建立了一种可以检测CYP2C19 基 因 多 态 性 的 PCR - 荧 光 探 针 法,对CYP2C19 基 因 CYP2C19 * 2、CYP2C19 * 3 和CYP2C19* 17 3 个位点的多态性进行定性检测,从而对 CYP2C19 代谢药物的疗效进行预测,指导临床医生用药安全有效。

  1 材料

  5x PCR buffer,dNTP mix 和 Taq DNA 聚合酶为Takara 公司产品。血液基因组 DNA 提取试剂盒为天根生化科技( 北京) 有限公司产品。引物由 In-vitrogen 公司合成。探针由 Applied Biosystems 公司合成。临床样本包括 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和CYP2C19* 17 位点杂合突变型和纯合突变型样本各 2 例,CYP2C19 基因野生型样本 2 例和 100 例随机全血样本,均由武汉大学人民医院提供。

  2 方法

  2. 1 检测方法的建立与优化 应用 Primer Premier5. 0 及 Primer Express 3. 0 软件针对 CYP2C19 * 2、CYP2C19* 3 和 CYP2C19* 17 位点序列设计引物和单核苷酸多态性( SNP) 探针。同时针对人类三磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase,GAPDH) 基因设计引物和探针作为内标系统,对 PCR 反应结果进行质量控制。野生型、突变型和内标探针分别用 FAM、VIC 和 ROX 染料进行标记。以相应的 2 例经测序验证分别为 CYP2C19*2、CYP2C19* 3 和 CYP2C19* 17 杂合突变型、纯合突变型和 CYP2C19 野生型的人类全血 gDNA 样本为模板,应用荧光 PCR 法筛选合适的引物和探针,建立和优化 CYP2C19 基因多态性检测荧光 PCR法。PCR 反应体系含 5x PCR 反应 buffer 5 μL,dNTP mix 0. 15 mmol·L- 1,引物 0. 2 μmol·L- 1,探针 0. 05 ~0. 5 μmol·L- 1之间,探针浓度及比例需要进行摸索,Taq 酶 0. 02 U,模板 2 μL,加 ddH2O 补足 25 μL.PCR 反应程序: 95 ℃,5 min,1 个循环; 95℃ ,15 s,60 ℃ ,1 min,40 个循环( 在此阶段收集荧光信号) .每个样本分别用 3 种反应液进行检测,即采用 CYP2C19* 2、* 3 和* 17 PCR 反应液分别检测CYP2C19 681G > A、636G > A 点突变和-806C > T 点突变。根据样本的检测结果优化建立的检测体系。

  2. 2 方法的性能评价 将上述各 2 例经测序验证分别为 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和 CYP2C19* 17杂合突变型、纯合突变型和野生型样本,提取样本的基因 组 DNA,并 分 别 稀 释 至 15 ng · μL- 1和0. 5 ng·μL- 1,作为评价检测方法的质控品。其中15 ng·μL- 1杂合突变型和纯合突变型基因组 DNA作为模板,用于评价相对应的反应体系的准确性;0. 5 ng·μL- 1的杂合突变型基因组 DNA 作为模板,用 于 评 价 相 对 应 的 反 应 体 系 的 灵 敏 度; 而15 ng·μL- 1CYP2C19 野生型模板用于评价反应体系的特异性。

  2. 3 方法的临床适用性评价 选择 100 例人类全血gDNA 样本,用建立的 3 个反应体系进行检测,按照结果判定标准对检测结果进行判读,然后与样本的测序结果进行比对,用于评价新建方法的临床适用性。

  2. 4 统计学分析 应用 SPSS 16. 0 软件进行统计学分析。采用 McNemar-Bowker( 配对卡方) 检验分析2 种方法有无显着性差异。计算 Kappa 值,Kappa值 >0. 75,表明一致性好。

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