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可检测CYP2C19基因多态性的PCR-荧光探针法(2)

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2015-12-21 共4497字

  3 结果

  3. 1 方法的建立及优化 本研究建立的 3 个反应体系分别检测 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和 CYP2C19* 17 位点。最终确定 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和CYP2C19* 17 反应液中野生型 / 突变型探针的浓度分别为 0. 1/0. 2 μmol·L- 1、0. 2/0. 3 μmol·L- 1,0. 3/0. 3 μmol·L- 1.GAPDH 内标系统探针浓度为 0. 05μmol·L- 1.荧光定量 PCR 反应体系: CYP2C19 反应液( 包括5x PCR 缓冲液、dNTPs、特异性引物和探针、内标引物和探针、Taq 酶) 23 μL,DNA 模板 2 μL.为增加体系的特异性,将 PCR 退火温度从 60 ℃升高到62 ℃ .PCR 反应程序为: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s,62 ℃60 s( 收集荧光) ,40 个循环。

  3. 2 方法的准确性评价 各用 2 例 15 ng·μL- 1相应的纯合突变型和杂合突变型样本,每个样本作为模板 分 别 加 入 CYP2C19 * 2、CYP2C19 * 3 和CYP2C19* 17 反应液进行检测。结果显示 3 种反应液检测纯合突变样本时,FAM 通道检测结果均为阴性( Ct 值 > 36 或无 Ct 值) ,VIC 通道检测结果均为阳性( Ct 值≤36) ; 检测杂合突变型样本时,FAM通道( 野生型) 和 VIC 通道( 突变型) 检测结果均为阳性( Ct 值≤36) ; 所有样本的 ROX 通道( 内标基因) 有明显扩增曲线( Ct 值≤32) .结果表明建立的方法具有很好的准确性,结果见图 1.

  3. 3 方法的灵敏度评价 各用 2 例 0. 5 ng·μL- 1的杂合突变型样本对 3 个反应体系的灵敏度进行检测。结果显示 3 种反应液检测杂合突变型样本的FAM 通道( 野生型) 和 VIC 通道( 突变型) 结果均为阳性( Ct 值≤36) ,ROX 通道( 内标基因) 有明显扩增曲线( Ct 值≤32) .表明建立的方法可以检测低至浓度为每个反应体系约 1 ng 的人类全血 gDNA.结果见图 2.

  3. 4 方法的特异性评价 用 2 例 15 ng·μL- 1的野生型样本( CYP2C19* 1/* 1) 对 3 个反应体系的特异性进行评价。结果显示 3 个反应体系 FAM 通道检测结果均为阳性( Ct 值≤36) ,而 VIC 通道均为阴性( Ct 值 >36 或无 Ct 值) ,表明建立的方法具有很好的特异性,能够满足要求。结果见图 3.

  3. 5 方法的临床适用性评价 用 100 例临床样本验证方法的临床适用性。临床样本的 CYP2C19 基因型检测结果如下: 36 例为 CYP2C19* 1 /* 2 杂合突变型( 36 /100) ; 9 例为 CYP2C19* 2 /* 2 纯合突变型( 9 /100) ; 6 例为 CYP2C19* 1 /* 3 杂合突变型( 6 /100) ,1 例为 CYP2C19* 3 /* 3 纯合突变型( 1 /100) ; 2 例为 CYP2C19* 2 /* 3 杂合突变型( 2 /100) ; 2 例为 CYP2C19* 1 /* 17 杂合突变型( 2 /100) ,1 例为 CYP2C19* 17 /* 17 纯合突变型( 1 /100) ,其余为野生型。样本的测序结果与新建方法的 结 果 完 全 一 致 ( Kappa = 1. 00) ,结 果 见表 1.

  4 讨论

  CYP2C19 是 1993 年 Wrighton 首先从人类肝脏分离的一种酶[10],是 CYP450 酶系的重要成员,参与了许多药物的代谢,主要包括抗惊厥药( 如苯妥英钠) 、质子泵抑制剂( 如奥美拉唑) 、抗焦虑药( 如安定) 、抗 抑 郁 药 及 抗 疟 疾 药 ( 如 白 乐 君) 等。

  CYP2C19 存在着遗传多态性,可将人群分为快代谢型和慢代谢型。快代谢型人群,携带 CYP2C19 等位基因* 17 的杂合子和纯合子* 17/* 17,代谢药物比较快; 而慢代谢型人群,携带功能缺失型等位基因,可表现为纯合子 CYP2C19* 2/* 2 或* 3/* 3( 后者较为少见) ,也可能表现为杂合子 CYP* 2/*3,代谢药物缓慢,容易导致药物的不良反应的产生。因此临床治疗时,对于快代谢型患者应适当加大药量以达到有效血药浓度,而慢代谢型患者应当减小药量以防止药物的不良反应。

  氯吡格雷系新型的二磷酸腺苷受体拮抗剂,是一种新型的抗血小板药物,临床上用于心肌梗死、卒中、外周动脉疾病二级预防用药,成为冠心病患者经皮冠脉介入手术( percutaneous coronary intervention,PCI) 及急性冠脉综合征患者的主要治疗药物之一。

  氯吡格雷作为一种前体药物,本身没有活性,需要经CYP450 酶转化为活性代谢物,抑制血小板的活化和聚集。有研究报道 CYP2C19 等位基因突变纯合子* 2/* 2 型人群服用氯吡格雷时,不能将其转化为活性产物,导致支架内血栓的形成[11].目前大多数研究认为 CYP2C19 基因多态性与氯吡格雷抵抗存在关联性,其中以 CYP2C19* 2 关系最大。2010年美国 FDA 要求在氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19 与疗效的关系,并建议使用前须检测CYP2C19 基因的多态性。临床上对接受氯吡格雷治疗的患者检测 CYP2C19 基因型,制定个体化治疗方案,指导临床合理化用药,解决氯吡格雷抵抗或低反应的问题,有助于减少 PCI 术后支架内血栓的形成和主要不良心血管事件的发生。

  美国 FDA 批准了罗氏公司的 AmpliChip CYP450 Test 芯片,检测 CYP450 酶系的 CYP2D6 基因和CYP2C19 基因( * 1、* 2 和* 3) 的突变,通过鉴定患者基因型和表型分类来预测其代谢的水平[12].美国 FDA 也 批 准 了 INFINITI CYP2C19 Assay( CYP2C19 基因* 2、* 3 和* 17) 、Verigene CYP2C19 Nucleic Acid Test ( CYP2C19 基因 * 2、* 3 和 *17) 和 Spartan RX CYP2C19 Test System ( CYP2C19基因* 2、* 3 和* 17) ,检测 CYP2C19 基因的突变情况。国家食品药品监督管理总局批准了国内 2 个试剂盒: CYP2C19 基因检测试剂盒( DNA 微阵列芯片法) 和人 CYP2C19 基因分型检测试剂盒( 荧光PCR 法) .本研究建立的 CYP2C19 基因多态性检测方法( 荧光 PCR 法) 与上述 2 种国内商业试剂盒相比,增加了 CYP2C19* 17 位点的检测,使 CYP2C19基因分型检测更为全面; 而且具有更高的灵敏度,能检测低至 1 ng/反应体系的样本。与 CYP2C19 基因检测试剂盒( DNA 微阵列芯片法) 相比,本方法操作更为简单、快捷,整个检测过程可在 2 h 内完成,且具有更高的灵敏度。与人 CYP2C19 基因分型检测试剂盒( 荧光 PCR 法) 相比,除增加 CYP2C19* 17位点的检测之外,本研究采用 FAM 和 VIC 双通道探针实现在 1 个反应管中检测 1 个位点的突变情况,而该商业试剂盒是将 1 个位点的野生/突变情况分开至 2 个反应管中进行,本研究简化了反应体系和实验操作,也使结果判读更为方便、直观。

  综上所述,本研究建立了一种能准确、特异、灵敏、简便和快速检测 CYP2C19 基因多态性的荧光PCR 法。通过检测 CYP2C19 基因多态性,可以评估个体对受 CYP2C19 酶基因多态性影响的药物疗效,对指导临床合理用药,实现个体化治疗具有重要的临床价值和实践意义。

  参考文献

  [1] CGOLDSTEIN JA. Clinical relevance of genetic polymorphisms inthe human CYP2C subfamily[J]. Br J Clin Pharmacol,2001,52( 4) : 349

  [2] de MORAIS SM,WILKINSON GR,BLAISDELL J,et al. Iden-tification of a new genetic defect responsible for the polymorphismof ( S) - mephenytoin metabolism in Japanese[J]. Mol Pharma-col,1994,46( 4) : 594

  [3] KUBICA A,KOZINSKI M,GRZESK G,et al. Genetic determi-nants of platelet response to clopidogrel[J]. J Thromb Thrombol-ysis,2011,32( 4) : 459

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