有机化学论文
1. 4 酶活测定方法
取 4 支试管各加入0. 5 mL 羧甲基纤维素钠底物，与待测酶液一起在 50 ℃水浴下加热 5 min; 在第 1，2和 3 支试管中各加入 0. 5 mL 待测酶液，并在 50 ℃水浴中反应15 min; 反应后在 4 支试管中各加入 DNS 试剂 1. 5 mL，并在第 4 支试管中补加 0. 5 mL 的待测酶液; 取出并摇匀 4 支试管后在沸水浴中反应 5 min; 将试管迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至5. 0 mL; 以第4支试管试液为对照，在 530 nm 波长条件下测量第 1 ～3 支试管的吸光度后计算酶活力。酶活力的计算公式如下:酶活力 =nA0. 002 5Vt式中 A 为吸光度值; n 为酶液的稀释倍数; V 为加入反应的待测酶液体积，mL; t 为待测酶液与底物的反应时间，min。
2 结果与讨论
2. 1 酶活力测定条件优选
2. 1. 1 葡萄糖标准曲线的绘制分别测定系列质量浓度梯度葡萄糖工作液的吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图 1。由图 1 可知，葡萄糖质量浓度与吸光度之间的函数关系为 y = 0. 002 5x － 0. 004 9，Ｒ2= 0. 999 3。
2. 1. 2 测定波长的确定常见的 3，5 － 二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的波长有 480［8］，490［9］，520［10，11］，530［12］，540［13］和550 nm［14］。波长不同则吸光度值不同，据此计算出的酶活力也差别较大。笔者依据文献在 480，490，520，530，540 和 550 nm 下，分别测定不同质量浓度葡萄糖溶液和 DNS 试剂反应液的吸光度值，见图 2。并计算相对应的 Ｒ2，见表 2，以期得到适宜的测定波长。由图 2 可知，在 480，490 和 520 nm 处测得的吸光度值较其他波长下测得的大，结合表 2 分析可知，葡萄糖在该 3 处波长下的 Ｒ2( 分别为 0. 951 0，0. 953 5 和0. 995 0) 较其他波长下的偏低，说明吸光度值在 480，490 和 520 nm 下稳定性偏低，线性较差。由图 2 和表2 还可知，在 530 ～ 550 nm 内，吸光度值随着波长的增大而减小; 此外，随着葡萄糖质量浓度的增加，不同波长条件下的吸光度值差异也逐渐增大; 在 530 nm 处的Ｒ2大于 540 和 550 nm 处，说明不同质量浓度的葡萄糖和 DNS 试剂反应液的吸光度值在 530 nm 处较稳定，线性关系良好，所以选择测定波长为 530 nm。
2. 1. 3 温度变化对酶活力的影响分别配制液体纤维素酶和固体纤维素酶溶液，保持其他影响因素不变，改变水浴的温度，研究温度变化对纤维素酶活力的影响，结果如图 3 所示。由图 3 可知，2 种纤维素酶在 50 ℃ 时的酶活力出现较大值，说明纤维素酶的较佳反应温度为 50 ℃。
2. 1. 4 缓冲液的 pH 对酶活力的影响分别配制不同 pH 的缓冲液，保持其他因素不变，研究 pH 对纤维素酶活力的影响，结果如图 4 所示。
由图4 可以发现2 种纤维素酶在 pH =3 ～5 和8 ～11范围内的活力较低，在 pH = 6 时酶活力出现最大值，故可认为 2 种纤维素酶均为中性纤维素酶，且最适pH = 6。为方便对中性纤维素酶的活力进行测定，建议选取 pH =6 测定酶活力。
2. 1. 5 吸光度对酶活力的影响保持其他影响因素不变，通过改变纤维素酶的稀释度，使测得的吸光度值在 0. 1 ～1. 1 之间，研究吸光度值对纤维素酶活力的影响，结果如图 5 所示。由图5 可知，吸光度值为 0. 2 ～ 0. 4 时，计算出的液体纤维素酶活力集中分布在 4 900 ～ 5 500 U/g，固体纤维素酶活力集中分布在 2 600 ～3 000 U/g。可以看出吸光度值控制在 0. 2 ～0. 4 时，所测得的纤维素酶活力相对稳定。故在测定纤维素酶活力过程中，需调整稀释度，将吸光度值控制在 0. 2 ～0. 4 内。综上，纤维素酶活力检测的较佳条件为: 波长为530 nm、酶促反应温度为 50 ℃ 、pH = 6、吸光度值为0. 2 ～ 0. 4，在该条件下所测纤维素酶活力较稳定。
2. 1. 6 验证实验在上述优选条件下进行 3 次重复实验，结果列于表 3。由表 3 数据可知，在实验确定的适宜条件下，所测得的液体纤维素酶和固体纤维素酶活力值较稳定，重复性好。
2. 2 洗涤剂中纤维素酶活力的测定
2. 2. 1 在液体洗涤剂中的测定选取 3 种市售不含纤维素酶的液体洗涤剂，然后加入占液体洗涤剂质量 1% 的液体纤维素酶，测定纤维素酶在液体洗涤剂中的活力，比较纤维素酶在不同pH 条件下酶活力的差异，结果见表 4。测得市售 3 种液体洗涤剂的 pH 分别为 8. 7，7. 8 和 8. 9，故选取与这3 种液体洗涤剂 pH 相近的缓冲液 1 ( pH = 8. 0) 作为对照。由表 4 可知，在 pH =7. 8 的市售液体洗涤剂 2 中测得的液体纤维素酶 1 和 2 的活力值较缓冲液 1 中测得的纤维素酶 1 和 2 的活力值有 67 和 637 U/g 的差距; 在 pH =8. 7 和 8. 9 的另外 2 种液体洗涤剂中测得的液体纤维素酶 1 的活力值与在缓冲液 1 中测得的液体纤维素酶 1 的活力值相比较，分别有 88 和 190 U/g的差距; 测得的液体纤维素酶 2 的活力值与在缓冲液1 中测得的液体纤维素酶 2 的活力值相比有 77 和484 U / g的差距。
在液体洗涤剂背景的存在下和没有液体洗涤剂背景的存在下，所测定的液体纤维素酶的活力数值有差别是由于 pH 对纤维素酶活力测定的结果影响很大，另外液体洗涤剂中不同的配方组分对于酶活力测定也有干扰。
2. 2. 2 在洗衣粉中的测定选取 3 种市售不含纤维素酶的洗衣粉，然后加入占洗衣粉质量 4% 的固体纤维素酶，用缓冲液溶解洗衣粉，离心 15 min 取上清液测定固体纤维素酶的活力，比较固体纤维素酶在不同的环境下酶活力的差异，结果如表 5 所示。测得市售的 3 种洗衣粉溶液的 pH分别为 9. 5，9. 8 和 9. 5，故选取与这 3 种洗衣粉溶液pH 相近的缓冲液 2( pH = 9. 0) 作为对照。由表 5 可知，在 pH =9. 8 的市售洗衣粉 2 溶液中测得的固体纤维素酶 1 和 2 的活力值较缓冲液 2 中的纤维素酶活力值有110 和206 U/g 的差距; 在 pH 均为9. 5 的另外 2 种洗衣粉溶液中，测得的固体纤维素酶 1的活力值与在缓冲液 2 中测得的固体纤维素酶 1 的活力值相比较，分别有 84 和 318 U/g 的差距; 测得的固体纤维素酶 2 活力值与缓冲液 2 中测得的固体纤维素酶 2 的活力值相比有 76 和 225 U/g 的差距。分析固体纤维素酶的活力在洗衣粉背景存在下和没有洗衣粉背景存在下的测定数值差别，其原因同液体洗涤剂。
液体和固体纤维素酶平行样的吸光度值见表 6 和表 7。由数据可知，在测定液体洗涤剂和洗衣粉中纤维素酶活力时，平行样标准偏差小，重复性好。数据显示该实验方法适用于测定液体洗涤剂和洗衣粉中纤维素酶的活力。
3 结论
采用纤维素酶羧甲基纤维素酶活的方法测定纤维素酶活力，适宜测定条件为: 波长为 530 nm，酶促反应温度为 50 ℃，pH =6 且吸光度值控制在 0. 2 ～0. 4 内。
在液体洗涤剂和洗衣粉中添加不同量纤维素酶的条件下，考察该方法的适用性，结果显示，此方法可用于液体洗涤剂和洗衣粉中纤维素酶活力的测定。【表略】
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