髓源性神经干细胞与运动神经元的miRNA的表达谱测定

　　微小的 RNA 简称 miRNA,是一种在真核生物中体内发现一种具有很强的内源性和调控性的 RNA,这种RNA 的长度大约在 20 ~ 24 个核苷酸之间,它们之间相互联系,共同通过蛋白质的表达谱来决定细胞是否进行分化以及正常的胚胎发育.目前对于髓源性神经干细胞与运动神经元细胞的研究引起了人们的关注,而比较二者差异的前提就是对于二者的 miRNA 表达谱进行准确的测量以及定量分析.髓源性神经干细胞与运动神经元的 miRNA 表达谱测定技术中的 TaqMan 低密度阵列( TaqMan low - density,TLDA) 技术对于二者的表达谱测定具有很强的可行性.本研究将 TLDA 技术应用于髓源性神经干细胞与运动神经元的 miRNA 的表达谱测定,现报道如下.

　　1 材料与方法

　　1. 1 一般材料 本次实验主要采用的主要是生产商家Applied Biosystems 生产的与脊髓源性神经干细胞和神经元的 miRNA 相关的实验的试剂,比如 TaqMan geneexpression master mix、Transcription Kit 等等.其次就是本次实验常用的实验仪器,比如紫外分光光度仪、7300荧光定量 PCR 系统等等.另外本次实验还需要配制一定量的 RNase - free 水,其主要目的是用来抽提 RNA 或反转录用.RNase - free 水的配置过程中需要使用RNase - free 玻璃瓶,然后向超纯水中加入 DEPC 至终浓度为 0. 01%( v/v) 即可[1].

　　1. 2 主要技术方法 本次实验和研究主要采用的是Applied Biosystems 公司的 TLDA 技术实现对 miRNA 表达谱的技术检测.对于 miRNA 表达谱进行检测的一般步骤或是流程主要包括以下几个方面.第一步是对于实验相关的神经干细胞以及运动神经元的培养,供以下的实验所用.第二步是对已培养的细胞的总 RNA 所谓提取与纯化,以及对于提取 RNA 的浓度和纯度进行测定和记录.另外我们采用免疫磁珠法对于脊髓细胞神经元进行纯化.第三步是利用 Megaplex 对 RNA 进行逆转录,从而获取细胞标本中隐含着的 miRNAs 的 cDNA文库,并综合利用实时 PCR 技术对于提取的 cDNA 的产物进行质量检测.其中对于 RNA 的浓度的测量就用到了我们已经配制好的 RNase - free 水,同时 RNA 的纯度应该在 1. 8 ~2. 0 之间.对 cDNA 的产物进行质检的主要目的是初步验证该产物是否可用于随后 miRNA 的TLDA 筛选.第四步则是采用 TLDA 对二者的表达光谱进行检测,利用定量 PCR 平台进行 miRNAs 的定量.第五步则是对于每一步的实验数据以及实验现象进行总结和分析[2].

　　1. 3 观察标准 对于髓源性神经干细胞与运动神经元反转录的 cDNA 产物,我们会分别利用 Array A 和 ArrayB 中的 U6 snRNA 进行了扩增,然后对二者的结果通过PCR 平台进行定量,分析定量结果[3].同时根据 TLDA对二者的表达光谱的检测结果,对于运动神经元中的表达信息进行确定.

　　1. 4 统计学处理 通过 RQ Study 软件对于实验进行定量分析,定量的结果以及组间比较采用 GraphPadPrism 5 软件进行 t 值检验,计量资料用均数 ± 标准差( x± s ) 表示,以 P <0. 05 为显着性检验标准.

　　2 结果

　　2. 1 Array A 和 Array B 中的 U6 snRNA 表达情况 在利用 Array A 和 Array B 中的 U6 snRNA 进行了扩增之后,通过 PCR 平台对于二者的 Ct 值进行了比较,具体的比较结果表 1 所示.通过对于二者的 Ct 值进行比较,很明显可以看出它们之间的差异很小,说明一致性很好,可以进行下一阶段的表达光谱检测.

　　2. 2 髓源性神经干细胞与运动神经元的 miRNA 表达谱检测结果 通过 TLDA 对于二者的 miRNA 表达色谱的测量结果总结,以及对于图像的分析,髓源性神经干细胞与运动神经元两种细胞的扩增曲线呈现出明显的"S"形曲线,可见二者的表达性差异.通过对定量结果的及时调整和分析,当相差倍数的绝对值大于 2 的时候,在运动神经元中高表达的 miRNA 共有 60 个,低表达的 miRNA 共有 35 个,由此我们鉴定了运动神经元中的基本表达信息[4].

　　为了进一步验证 TLDA 技术的特异性以及结果的可靠性,本次实验还会采用具有高度特异性的单管 qPCR 方法,对于4 种具有代表性的 TLDA 筛选出来的4 种具有差异性的 miRNA 进行表达检测,并对检测结果进行定量结果分析,并进行相关线性比较,经过模拟曲线得出线性相关 r =0.978,P =0.017.具体的分析结果如表2 所示.

　　3 讨论

　　传统的脊髓运动神经元细胞的培养主要采用的是机械或是酶学的方法进行,这样在对单个细胞进行分离之后就可以将分离出来的细胞的悬液直接进行体外培养,这种方法不仅复杂而且耗时、耗费材料.在本实验中我们采取的是免疫磁珠法,不仅耗用的时间少,而且可以很好的保持细胞的活性,目前取得了良好的应用效果[5,6].miRNA 是一种很长的非编码的小的 RNA,在不同的细胞中都具有很大的差异性,表达水平也不尽相同,要想找出相关细胞中 miRNA 的差异性,必须对它们的 miRNA 表达谱进行检测和分析,对于细胞的 miRNA表达谱的分析与检测也是对于 miRNA 研究的重要内容之一[7].采用 TLDA 技术对细胞的 miRNA 表达谱的测量不仅敏感性好,还可以有效排除一些非 RNA 物质的干扰,同时在进行定量分析时的样品消耗也比较少,对于髓源性神经干细胞与运动神经元的 miRNA 表达谱的测定和研究具有重要的意义[8].

　　本文通过 TLDA 对于二者的 miRNA 表达色谱的测量结果总结,以及对于图像的分析,髓源性神经干细胞与运动神经元两种细胞的扩增曲线呈现出明显的"S"形曲线,可见二者的表达性差异.通过对定量结果的及时调整和分析,当相差倍数的绝对值大于 2 的时候,我们发现在运动神经元中高表达的 miRNA 共有 60 个,低表达的 miRNA 共有 35 个,由此我们鉴定了运动神经元中的基本表达信息[9].对于 4 种具有代表性的 TLDA筛选出来的 4 种具有差异性的 miRNA 进行表达检测,并对检测结果进行定量结果分析,并进行相关线性比较,经过模拟曲线得出线性相关 r =0. 978.由此可见,TLDA 技术在髓源性神经干细胞与运动神经元的 miR-NA 表达谱检测中发挥重要的作用,值得推广和应用.

　　4 结论

　　髓源性神经干细胞与运动神经元两种细胞的扩增曲线呈现出明显的"S"形曲线,可见二者的表达性差异.且 TLDA 技术在髓源性神经干细胞与运动神经元的 miRNA 表达谱检测中发挥重要的作用,值得推广和应用.

　　参考文献

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