石蜡和冰冻切片检测牛蛙肝糖原的染色效果比较

　　肝糖原是人和动物体内的贮备多糖，有“动物淀粉”之称，肝糖原在酶促作用下合成和分解以维持血糖浓度稳定。检测肝糖原含量变化在医学病理学上可用于糖原累积病﹑糖尿病和某些肿瘤的诊断［１］，在养殖生产实践中可用于了解动物的营养状况以指导合理饲喂。高碘酸希夫氏 （ｐｅｒｉｏｄｉｃ　ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ′ｓ，ＰＡＳ）染色法是检测糖原的经典组织化学方法，该法先用高碘酸将糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Ｓｃｈｉｆｆ＇ｓ试剂（无色品红）和醛基反应产生红色或紫红色物质，红色的深浅反映组织细胞中糖原的含量。目前对肝糖原ＰＡＳ染色过程中样品固定、染色试剂的配制与储存、染色时间等方面研究报道较多［２－４］，切片方法均为石蜡切片，冰冻切片制作过程时间短、效率高，但尚未见有关用冰冻切片检测肝糖原的研究报道。

　　牛蛙属经济养殖型蛙类，具有重要的生态价值和经济价值，也是重要的科研和教学用实验动物。

　　本试验分别制作了牛蛙肝组织石蜡和冰冻切片，采用ＰＡＳ染色法检测肝糖原，通过光密度分析测定糖原含量，比较了两种切片的染色效果，供相关教学与科研技术人员参考。

　　材料和方法

　　１．材料

　　成体牛蛙３只，重２５０－３００ｇ，购自芜湖市黄山菜市场，穿刺脊髓处死，迅速解剖，取出肝脏，用吸水纸轻轻拭干，勿用水或生理盐水清洗。

　　２．实验方法

　　２．１石蜡切片

　　将肝脏切成约１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，用Ｃａｒｎｏｙ固定液于低温４℃固定约４ｈ，分别用９５％乙醇和无水乙醇脱水２ｈ、二甲苯透明、浸蜡、包埋，常规切片厚５μｍ，水中展片。

　　２．２冰冻切片

　　将肝脏切成约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，放在组织支撑器上，滴加冷冻包埋剂后放入冰冻切片机中低温固化后切片，切片厚５μｍ。

　　２．３ＰＡＳ染色

　　对照组取石蜡切片常规脱蜡至５０％乙醇后稍水洗，与冰冻切片同时滴加唾液淀粉酶溶液于３７℃温箱中消化处理３０ｍｉｎ，消化过程中实验组石蜡切片脱蜡至５０％乙醇后稍水洗，将实验组、对照组的石蜡、冰冻切片入０．５％高碘酸氧化７ｍｉｎ，流水冲洗５ｍｉｎ再用蒸馏水浸洗两次；冰箱取出无色品红待至室温后避光染色１５－２０ｍｉｎ；用０．５％的偏重亚硫酸钠漂洗两次，每次约１ｍｉｎ，流水冲洗５ｍｉｎ，蒸馏水洗 后Ｈａｒｒｉｓ苏 木 精 染 色２ ｍｉｎ；自 来 水 洗，０．１％的盐酸乙醇分化１ ｍｉｎ，水洗充分后温水返蓝，流水冲洗，４２℃温箱烘干２４ｈ，中性树胶封固。

　　２．４光密度测定与数据统计分析

　　在Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ６１型显微镜下观察拍照，采用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ图像分析软件对染色阳性部位进行光密度分析，测出切片中ＰＡＳ阳性部位的累积光密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ＩＯＤ）和面积，算出平均光密度（ｍｅａｎ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ＭＯＤ）。采用单因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）进行差异显着性比较，Ｐ＜０．０５为差异显着。

　　结果

　　ＰＡＳ染色后糖原颗粒呈红色或紫红色，石蜡切片染色后肝脏组织结构较为清晰，但肝细胞内有较多空泡，糖原流失较多，且偏向了细胞的一侧（图１），冰冻切片肝细胞形态保持完好，糖原颗粒明显比石蜡切片中大，且糖原保持较好的原位状态（图２）。

　　光密度分析显示冰冻切片糖原含量显着高于石蜡切片（Ｐ＜０．０５）（表１），与冰冻切片相比，石蜡切片中糖原流失了２８％左右。

 

　　讨论

　　１．取材与固定

　　制作石蜡切片时，不同的固定方法对肝糖原的显示影响较大，采用Ｃａｒｎｏｙ固定液固定可较好地保存糖 原，此 外，低 温４℃下 固 定 也 可 防 止 糖 原 丢失［２］；冰冻切片无需对材料进行固定处理，直接取材冷冻包埋后切片即可。

　　２．切片与展片

　　王珏等认为肝脏的石蜡切片厚度一般在３μｍ为宜，组织太厚或太薄均不利于观察［３］。制作３μｍ冰冻切片材料极易破碎，本实验冰冻切片厚度为５μｍ，染色后效果亦较为理想。有报道认为在７０％酒精中展片可防止糖原流失染色效果较好，我们在实验中发现在７０％酒精中和清水中展片染色效果无明显差异，可能是由于材料经石蜡包埋，短时间水中展片不会导致糖原的流失。

　　３．试剂配制

　　实验采用无色品红染色，本试剂因配制需活性炭吸附过滤，配制耗时较长，可适量多配制一些后在４℃冰箱避光保存。另外，本实验在配制无色品红时发现若未经活性炭吸附时溶液已基本无色，则该试剂与经活性炭吸附后的试剂染色效果相同。有研究认为，对于失效无色品红溶液，在约每１００ｍｌ试剂中加入０．５ｇ偏重亚硫酸钠，可恢复其染色能力［４］，其他试剂均可现配现用。

　　４．对照实验

　　可用０．１％淀粉酶与３７℃保温箱中反应１ｈ左右，本实验发现将唾液稀释６－９倍于双层纱布过滤两次后在３７℃保温箱中反应３０ｍｉｎ左右，效果亦较为理想。不过，反应时间应把握较为准确，时间太短糖原未分解彻底，时间太长又易致其它组织结构分解，且染色冲洗时易掉片。实验组两种切片经高碘酸氧化后均不易掉片，但对照组由于经过酶消化易掉片，冲洗时应小心，对照组染色后ＰＡＳ阴性，证明实验组ＰＡＳ阳性物质为糖原。

　　５．染色结果

　　石蜡切片染色后肝脏组织结构虽然较为清晰，但肝细胞内有较多空泡，可能是由于制片脱水过程中糖原溶解流失形成的。糖原偏向了细胞的一侧，有报道认为这是由于固定剂把细胞内的糖原推向固定剂对组织浸透的方向而造成［２］；冰冻切片为切片后直接染色，因此可很好地保留糖原及其在细胞中的位置。

　　总之，石蜡和冰冻两种切片方式均可用于糖原染色，由于糖原易溶于水，两种切片材料未经高碘酸氧化前均不宜与水接触，但制作石蜡切片时脱水脱蜡过程中不可避免要与水接触，必然会造成不同程度的糖原流失，而冰冻切片可直接切片染色，无需与水接触，不会造成糖原流失；石蜡切片制作实验环节较多，耗时较长，通常要４８－７２ｈ，而冰冻切片制作实验环节较少、耗时短，只需５－６ｈ。但冰冻切片需要冰冻切片机，价格较昂贵，没有石蜡切片机那么普及。本研究结果显示，在条件许可的情况下，临床病理诊断和生产实践中检测糖原含量变化时，应选用制作方便、耗时短且糖原不易流失的冰冻切片。

　　参考文献

　　［１］付银锋．ＰＡＳ染色方法及应用．河南科技大学学报（医学版），２００８，２６（２）：１００－１０１

　　［２］尹洪萍，袁红．不同固定方法对肝糖原显示的影响．杭州师范学院学报（自然科学版），２００５，４（６）：４７９－４８０

　　［３］王珏，王莉，张健．不同组织中ＰＡＳ染色的特点．郧阳医学院学报，２００９，（５）：５０５

　　［４］方庆全，叶美华，黄红浪．提高病理高碘酸雪夫氏法染色效果的体会．临床和实验医学杂志，２００９，８（１２）：１２５－１２６