第三方医学检验在分子诊断检测的优势和注意问题

　　人类基因组计划完成以及后基因组时代的功能基因组研究， 不但发现了疾病的发生发展与特定基因的存在（易感基因）、状态（表观遗传学）及表达（mRNA 及蛋白）有关，而且编码药物代谢酶的基因的多态性还与患者的疾病治疗特定用药密切相关[1],基因检测在临床上的重要性越来越显着， 也逐渐成为 21 世纪生物医学领域最有潜力的学科之一，成为当代医学发展的重要前沿领域。 所以新的分子检验技术和检验项目不断涌现，高精尖的仪器设备越来越多地进入临床检验实验室。

　　分子诊断是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化从而对疾病进行诊断的学科。 分子诊断有力地推动了检验医学在疾病诊断和评价预后方面作用的发展，开辟了现代检验医学在个体治疗应用的新领域[2~4]. 分子诊断在肿瘤诊断、靶向用药以及预后，遗传病的诊断、感染性疾病的诊断、治疗监测以及耐药基因检测，药物不良反应及疗效监测等众多领域均有重要的意义[5~8]. 分子诊断对实验室硬件设备及操作人员能力均要求较高， 与分子诊断快速发展相矛盾的是大多数中小医院，单独凭一个检验医学科的人力物力已很难组建一个完善的分子检测实验室。 即使部分大型综合医院勉强购进相应的设备、安排相应的人员，也往往因为标本的数量有限，从而造成医院巨大的人力和财力的浪费。 二者之间的矛盾决定了第三方医学检验在分子诊断市场中的广阔前景。 本文从目前国内分子诊断现状、第三方医学检验在分子诊断中的优势等几个方面阐述第三方医学检验在分子诊断项目中的应用、前景及必要性。

　　1 目前国内分子诊断的现状
　　
　　PCR 技术自 1983 年发明以来， 因其极高的检测特异性和敏感性，在上个世纪 90 年代，即在我国临床实验室迅速开展，但由于实验室不规范和人员缺乏质量意识，到 90年代中期，出现大量的假阳性结果，临床反映强烈，因此卫生部在 1998 年 4 月下文暂停了聚合酶链反应（polymerasechain reaction,PCR）在临床检验中的应用 . 后经过充分准备，卫生部发布了《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10 号），要求凡是开展向患者收费的临床基因扩增检验项目的实验室， 必须按规范进行分区，配备必要的仪器设备，人员必须经过卫生部或各省市临床检验中心组织的上岗培训，持证上岗。 具备上述“硬件”条件后，还需建立实验室质量保证体系[9]. 另外，建立标准化的PCR 实验室是进行临床分子诊断的基础 ,根据 CNAS《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》的要求，标准化的 PCR 实验室包括样本处理区、试剂准备区、扩增区和产物分析区共 4 个区[10].
　　
　　分子诊断需要应用大量的分子生物学技术，这些技术主要包括 DNA/RNA 提取，PCR 技术，RNA 逆转录技术，基因重组技术、核酸电泳技术、DNA 测序技术、荧光原位杂交（flurescence in situ hybridization,FISH）技术、生物芯片技术等[11]. 所以这些技术对实验室人员的知识结构 、教育背景以及操作能力均要求比较高。 在基因检测设备上，实验室也需具备荧光定量 PCR 仪、离心机、加样器、加热模块、电泳仪、核酸提取仪、测序仪等设备。

　　所以，开展分子诊断检测项目，在人员资质、实验室分区、众多检测技术以及设备等方面均要求较高。 而我国目前医疗资源分布严重不均衡，从乡镇卫生院到大型三甲医院的诊疗水平相差非常大，特别是社区服务站与乡镇卫生院的实验室设备简陋，硬件水平较差，同时从事基层检验工作的人员少、学历低、质控意识差、很少有建立实验室管理手册（项目或仪器 SOP）文件，却担负着各自辖区大部分临床检测任务[12]. 所以目前随着个体化医学的发展 ,很多县市医院甚至一些三甲医院的基因检测项目不能满足临床需要。

　　2 国内第三方医学检验现状
　　
　　国内医学独立实验室的发展始于 20 世纪 80 年代中期。 这一时期，我国的独立实验室处于萌芽阶段，所有的检验机构均规模较小，且大多为医院的附属机构。 在我国能够称为真正意义上的医学独立实验室是成立于 1994 年的广州金域医学检测中心：由广州医学院、广州市金域医学科技有限公司和广州生物工程中心三方共同出资设立，是我国最早获得《医疗机构执业许可证》并进入医学检验市场的独立实验室。 6 年后，中山大学达安基因、杭州艾迪康、浙江迪安、上海美众等医学独立实验室相继成立。 至2005 年，已有广州金域、达安基因和艾迪康 3 家规模相对较大的医学独立实验室开始尝试全国连锁经营模式。 2013年，中国独立实验室规模已达 35 亿元，市场规模同比增长70%,尽管这样，因为独立实验室在中国发展相对较晚 ,整体规模仍然有限，仅占整个医疗诊断总收入的 2%~3%,与美国超过 30%的份额相差甚远[13]. 目前，金域检验、迪安诊断、 达安基因和艾迪康 4 家大约占了 70%的市场份额，金域检验大约占市场份额的 40%. 2012 年 10 月，国务院下发的《卫生事业发展“十二五”规划》（简称《“十二五”规划》）在关于如何加强医疗服务体系建设的部分，明确提出优化配置医疗资源，“遏制公立医院盲目扩张”,“切实保障边远地区、新区、郊区、卫星城区等区域的医疗资源需求”,“区域卫生规划和医疗机构设置规划中， 为非公立医疗机构留出足够空间，在符合标准的条件下，优先考虑社会资本。 医学独立实验室的主要服务对象是广大的民营医疗机构、社区医院、县级医院等，国家政策对这些医疗机构的扶持，就是对我国医学独立实验室发展的利好。 因此，第三方实验室在新的国家政策下具有非常大的发展空间。

　　3 第三方医学检验在分子诊断检测中的优势
　　
　　3.1 节约成本
　　
　　目前临床上分子诊断检测项目众多，在临床中应用的可以达到上千种，但是许多分子诊断检测项目样本量并不是很大，甚至比较罕见。 像分子诊断项目中感染类疾病丙肝核酸定量， 该项目每次实验需要同时做 4 个标准品，高值低值阳性质控品以及阴性质控品。 因为每次实验标准品及阴阳性质控品数量是固定的，所以样本量越大，成本越低。 如果某单位该项目样本量非常少将大大提高检测试剂成本，并且还需要投入人力及荧光定量 PCR 仪。 另外，临床上技术发展越来越迅速，检测技术方法及仪器更新越来越快，像目前出现的高通量测序技术（high-throughput se-quencing），又称下一代测序技术 （next-generation sequenc-ing technology），该仪器可以快速检测 DNA 突变 、 多态性等[14],但高通量测序仪器价格昂贵 ,适用临床项目不多 ,所以目前相关检测项目多集中在第三方检测中心。 第三方检验平台高效优质的服务，避免了中小型医疗单位不必要的检验仪器投入和人员配置，可大幅减低成本。

　　3.2 提高检测水平
　　
　　目前， 分子诊断项目在国内正逐渐为临床医生所认同，但由于检测方法众多，并且相当一部分项目没有 FDA批准的试剂盒，检测质量良莠不齐，所以检测水平亟待提高。 美国分子检测试验一般分为三类， 食品药物管理局（Food and Drug Administration,FDA） 批准的项目 、 修改FDA 批准的项目和实验室自建项目 （Laboratory Develop-ment Test,LDT）。 FDA 批准的项目一般由公司将检测试剂做成试剂盒进行申报， 经 FDA 验证后批准在临床实验室采用。 LDT 是各个实验室自己建立，并自发在实验室和临床进行验证，遵循质量管理要求进行开展，目前在国外分子实验室开展的大多数项目属于此类项目。

　　相当一部分遗传性疾病的筛查、先天性遗传病的产前诊断项目在临床上需求量不是很大，但是对患者的疾病诊断却至关重要，这种检测通常需要采用 LDT,因为实验对象（即患者）相对局限或者稀少，使得厂家投入产出比过低，而不愿意使之商业化[15,16]. 该类分子诊断项目检测部门比较少，集中在少数大型三甲医院，通过第三方医学检验平台可以整合这些大医院的优势医疗资源，患者可以就近享受高质量的检验诊断服务，极大的方便了患者。 而对于这些特色专科医院，样本量的增大可以提高检测人员的经验和水平，并可以加大高水平检测仪器的投入进一步提高检测水平。

　　3.3 提高临床大夫诊疗水平疾病的诊断水平与检测能力息息相关，第三方医学检验平台的存在可以使临床大夫的检测不需要仅局限在本医院的检测能力， 可以根据患者病情需要进行相关检测，可以很大程度提高临床大夫的诊疗水平。 同时，患者也可以不必因为医院检测能力有限而转院，医生的诊疗水平和科研能力、医院的经济效益均能得到很大的提高。

　　4 第三方医学检验
　　
　　在分子诊断项目检测中需要注意的问题
　　
　　4.1 分析前质量保证
　　
　　基因检测项目对标本的采集及处理均有比较严格的要求，在基因项目检测中，涉及的标本比较广泛，常见的有血清、血浆、全血、组织、分泌物、骨髓以及石蜡切片等。 标本采集应使用密闭的、一次性、无菌及无核酸酶的容器。 如果使用血浆、骨髓及全血样本，一般应使用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetracecetic acid,EDTA）或枸橼酸钠作为抗凝剂的采血管。 肝素因对 PCR 扩增有很强的抑制作用，且在后面的核酸提取中很难去除，应避免使用。 完成标本采集后标本应尽快送到实验室，实验室应尽快登记标本条形码号、患者信息、检验项目、采样时间、标本类型等，同时检查标本是否有溶血、严重脂血等，对影响检验结果的标本不予登记外送。 像丙肝核酸定量等 RNA 检测项目，实验室需要及时将标本离心处理并分装冻存。

　　4.2 分析中质量保证
　　
　　采用已知弱阳性和阴性质控品进行室内质量控制（Internal quality control,IQC）是保证检测质量的重要环节之一。 其监控的是实验室最重要的性能指标即重复性，并决定了当批试验测定是否有效。 实验室常规检测除了重复性外，另一个重要的指标是准确性，或不同实验室间的可比性。这通常是通过室间质量评价（external quality control,EQC）或实验室间比对来完成[17]. 第三方实验室在进行分子诊断项目检测时，必须要严格执行 IQC 和 EQC 的要求，这样才能保证结果的准确可靠。 另外对于 LDT 项目，实验室尤其要注意检测中的质量保证。

　　4.3 分析后质量保证
　　
　　由于基因检测的复杂性， 检验人员对检测结果的分析、报告和解释应该加以重视。 基因检测结果多与遗传背景等多种因素有关，所以检测人员在分析结果时务必综合考虑各种因素，在保证检测结果准确的前提下，对检测结果进行合理的解释。 英国临床分子遗传协会在 2009 年就颁布了 《sanger 测序结果分析解读的实践指南》（PracticeGuidelines for Sanger Sequencing Analysis and Interpreta-tion），可以对临床测序项目进行系统有效的指导。 分析人员分析结果时要时刻关注相关疾病诊疗指南的更新，在结果报告中应该附上指南的内容，指导临床诊疗，这与常规临床检验差别较大，结果分析和报告审核人员的综合素质要求高，应该由具备临床医学、检验医学、病理学、药学、遗传学等相关专业背景的人员来进行[18].

　　人类基因组计划、单核苷酸多态性计划和国际人类基因组单体型图计划的完成为疾病的分子分型和个体化诊疗提供了科学基础，也为科研成果快速向临床转化提供了可能[19]. 2006 年第一次证明可以通过母体血浆核酸检测诊断 18-三体、21-三体综合征[20],目前临床上应用二代测序进行无创产筛已经成为一种趋势，并且这些检测技术及服务为患者及临床医生提供了非常快速及准确的帮助[21,22].

　　第三方医学检验平台符合医学检验发展规律的必然趋势，有利于医学检验资源的优化组合，尤其是像分子诊断相关项目。 医院检验科是医学检验服务的主体，第三方检验（或独立实验室）是有益和必要的补充，第三方检验与医院既有竞争又有合作，二者应相互协作努力为患者打造价格更低廉、质量更优质的医学检验服务环境。

　　5 参考文献
　　
　　[1] 李金明。分子诊断技术引领医学临床实验发展[J].中华检验医学杂志，2014,37（5）：321-323.
　　[2] 关明，潘申柏。关于国内临床分子诊断发展的若干思考[J].中华检验医学杂志，2014,37（5）：327-329.
　　[3] Rosell R,Bivona TG,Karachaliou N.Genetics and biomarkersin personalisation of lung cancer treatment [J].Lancet,2013,382:720-731.
　　[4] Moorcraft SY,Smyth EC,Cunningham D,et al.The role ofpersonalized medicine in metastatic colorectal cancer:an e-volving landscape[J].Therap Adv Gastroenterol,2013,6:381-395.