表观遗传学在动物遗传育种中的应用

　　动物遗传学论文（8篇无删减范文）之第三篇

　　摘要：表观遗传学 (Epigenetics) 是指DNA序列没有变化, 而基因表达或表型却发生了可遗传并潜在可逆的改变, 对动物的生长发育、疾病抗性、繁殖等性状的表达起到了重要的调控作用。由于表观遗传学起到了解释传统遗传学对性状变异无法解释的作用, 因此, 近20年来, 其在家养动物育种领域的研究速度极为迅速。文中综述和分析了表观遗传学在猪、牛、羊和鸡等传统家养动物育种领域的研究现状及相关技术的发展趋势, 将对全面了解家养动物经济性状及优异性状形成的分子机制, 拓展改善经济性状的育种手段提供理论依据。

　　关键词：表观遗传学,动物遗传学,DNA甲基化,家养动物

　　自20世纪70年代末期, 随着改革开放的迅猛发展, 我国城乡居民生活水平迅速提高, 不仅对农业动物所提供的肉蛋奶等传统的动物性食品数量呈逐年刚性增长的态势, 而且对动物型食品的质量与品质的要求也日益增高, 同时人们对动物提供的观赏、伴侣与精神生活紧密相关的需求也与日俱增, 因此, 以传统性的畜禽为主体的农业动物生产的发展速度也呈逐年递增的趋势, 但农业动物产业最上游的动物种业特别是畜禽品种几乎完全依赖于引进的国外品种, 具有自主知识产权的动物种业则处于起步阶段。农业动物种业是集成现代生物技术、信息技术等技术含量极高的产业, 与国外已经进行几十年和上百年通过传统育种技术形成的农业动物种业相比, 我国若想通过国外的方式发展自己的农业动物种业已不再现实, 因而充分利用现代生物科技加速我国农业动物品种选育的速度已成为必然。

　　表观遗传学 (Epigenetics) 是指DNA序列没有变化, 而基因表达或表型却发生了可遗传并潜在可逆的改变[1,2]。这种改变通常是细胞内除了DNA遗传信息以外的其他可遗传物质发生了改变 (如DNA甲基化等表观遗传修饰) , 即基因型无变化而表型却出现了改变, 并能通过有丝分裂与减数分裂在代内 (Intro-generation) 及代间 (Inter-generation) 稳定遗传[3,4,5]。从表观遗传学概念可以看出, 并不是所有的遗传信息都包含在DNA序列里, 同时也存在于表观基因组一些其他类型的修饰中[6]。换言之, 基因组中主要包含两类重要的遗传信息:一类是传统意义上的由DNA序列所提供的遗传信息, 而另一类是新兴的表观遗传修饰信息, 它提供了在何时、何处并且以何种方式来执行第一类遗传信息的指令, 个体之间表观遗传修饰的差异会导致相应基因表达的差异, 由此引起表型的差异[7]。常见的表观遗传学机制主要包括有组蛋白修饰、DNA甲基化修饰和非编码RNA调控等[2]。近十几年中, 人类和小鼠等模式动物的表观遗传与疾病间的关系、表观遗传修饰对发育调控等方面研究的较为广泛而深入[8]。与人和小鼠相比, 农业动物方面则起步较晚, 但借鉴小鼠与人的研究思路, 逐渐形成了适合于畜禽遗传特征的表观遗传调控领域与方法[9]。在鸡、猪、羊、牛等家养动物上也相继开展了生长发育、产品品质、抗病及繁殖等重要经济性状相关的表观遗传调控机制的相关研究, 包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、基因组印记及染色质重塑等[5], 为阐明家养动物重要经济性状的形成机制提高了新的研究思路。

　　1 表观遗传学相关技术在家养动物遗传育种中的应用现状

　　1.1 表观遗传学相关技术在猪遗传育种上的应用

　　表观遗传学中的DNA甲基化和小RNA调控等技术, 应用于猪的遗传育种方面的研究不仅起步较早, 也相对较为广泛, 涉及猪的生长发育、疾病抗性及肉质性状等多个领域。蒋曹德等[10,11], 应用甲基敏感扩增多态技术 (MSAP) 分析了DNA甲基化与大白×梅山F1个体180日龄活重、料肉比、日增重、90 kg日龄、相对生长率和Kleiber (KR) 5个性状等生长性状的关系, 发现DNA甲基化是影响杂种表现或杂种优势的因素之一, 可以作为分子标记用于杂种优势的预测和相关的研究;对性状产生显着影响的甲基化位点在预测杂种表现中要优于其他甲基化位点。陈英等[12]通过对荣昌猪的研究发现, 荣昌猪基因组DNA甲基化水平随体重的增加呈下降趋势, 10~50 kg体重阶段下降幅度较小, 51~100 kg体重阶段下降幅度较大, 同时发现性别不是影响荣昌猪仔猪DNA甲基化状态的主要因素[13]。肖正忠等[14], 通过对长白猪×蓝塘猪及其杂种基因组DNA甲基化分析, 发现使用MSAP技术检测猪种基因组甲基化多态性非常有效, 且猪基因组甲基化多态性丰富, 杂种F1代与其父母代之间的基因组甲基化水平存在差异。李芳芳等[15]利用相对荧光定量PCR技术检测了WT1和FGF9基因在睾丸组织中mRNA表达量变化, 同时利用亚硫酸氢盐测序法分析了其启动子区Cp G岛甲基化状态, 发现WT1基因的异常表达可能是引起克隆猪发生隐睾的原因之一, 但其甲基化水平不是影响该基因异常表达的因素;克隆猪C1睾丸组织FGF9基因启动子区发生超甲基化, 这可能导致其mRNA表达异常, 从而成为诱导克隆猪隐睾发生的可能原因。张恬等[16]对猪脂肪沉积候选基因AOC3、PPARG1及SOD3 DNA甲基化差异进行了研究, 发现3个候选基因的检测区段DNA甲基化程度在IMF极高组、极低组间均未检测到明显差异, 表明该群体内的IMF含量表型差异可能并不是由这3个候选基因DNA甲基化程度的变化引起的。胡宇平等[17]对莆田黑猪不同组织DNA甲基化进行了MSAP分析, 发现DNA甲基化在莆田黑猪肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间存在组织特异性。Li等[18]运用甲基化DNA免疫沉淀测序技术检测了猪深浅两层的皮下脂肪组织, 全身不同部位脂肪组织, 以及两种不同肌肉组织的全基因组水平的甲基化差异, 发现与厚背膘猪相比, 薄背膘猪部分基因启动子区显着高甲基化, 这些基因与细胞因子调控正相关, 表明这些甲基化差异区域调控的靶基因与猪背膘厚有关;Li等[19]通过对猪肌肉组织和脂肪组织的miRNA表达进行比较发现, miRNA类型和表达水平在两种组织中均不相同, 表明猪皮下脂肪发育存在一种复杂的表观遗传调控网络;从而为脂肪沉积和肌肉生长的甲基化调控机制奠定基础;Hicks等[20]使用Illumina深度测序技术鉴定了巨噬细胞感染猪繁殖与呼吸道综合症病毒后高表达的miRNAs;Boherer等[21]利用高通量SOLi D测序技术比较了去势与未去势公猪上皮下脂肪组织中miRNA的表达差异情况;周中银等[22]运用RNA-seq技术鉴定了猪全基因组水平上长基因间非编码RNA (lincRNAs) ;Bonn等[23]运用甲基化DNA免疫沉淀技术鉴定了巴克夏、杜洛克和长白猪3个猪种的肝脏差异甲基化组图谱。上述研究均为今后进行猪性状相关的表观遗传修饰提供了良好的工作基础。但是由于猪重要经济性状产生和作用的分子机制异常复杂, 对于涉及其中的表观遗传修饰机制仍处于探索之中。

　　1.2 表观遗传学相关技术在牛遗传育种上的应用

　　目前表观遗传学相关技术在牛育种上的应用研究较为广泛, 不仅对牛克隆、胚胎方向上特定位点、特定区域、特定基因等DNA甲基化进行了研究, 而且对牛的经济性状、疾病抗性等与表观遗传相关标记也进行了研究。曹更生等[24]对牛不同供体核克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度进行了比较研究, 发现在同一个体中, FFB来源的克隆囊胚发育率比FOV的低, 但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比FOV的高, 这暗示不同供体核克隆囊胚的重编程是有差异的, 并可能影响到胚胎及个体的发育。蔡霞等[25]对DNA甲基化对牛Igf-2r表达的影响及其在克隆牛发育中的作用进行了研究, 发现DNA甲基化修饰影响Igf-2r基因的表达。正常牛不同组织中Igf-2r基因DMR2区的DNA甲基化程度不同, 提示Igf-2r基因的印迹调控方式在不同组织中可能不同。克隆牛发育过程中, 调控Igf-2r基因印迹的DMR2表观结构被明显改变, 而非印迹调控区3&apos;-UTR则无明显变化, 提示Igf-2r基因印迹调控区被破坏, 很可能是导致克隆牛发育异常的一个重要原因。李柯涵等[26]研究了牛体细胞中Gadd45a的表达与DNA甲基化修饰的关系, 发现DNA甲基化对牛Gadd45a基因的组织特异性表达有一定影响。陈洁等[27]对体细胞核移植牛肺脏中H19和Xist基因的DNA甲基化状态进行了研究, 发现体细胞核移植牛中H19基因甲基化程度较低, 与正常对照组相比差异显着 (P<0.05) , 并且9C3个体有3个Cp G (第1, 2, 3位) 表现出完全非甲基化;Xist基因甲基化程度在体细胞核移植牛和正常对照牛中都较高, 且没有显着差异;另外通过对Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析, 认为Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因[28]。辛鹏慧等[29]对牛4种组织中ZAR1基因表达及DNA甲基化修饰进行了研究, 发现DNA甲基化与牛ZAR1基因的组织特异性表达相关。苏建民等[30]对转基因克隆牛胎盘中印迹基因PEG10的DNA甲基化水平的研究发现, 胎盘中印迹基因的DNA甲基化表观重编程不彻底可能是导致转基因克隆牛发育异常进而死亡的主要原因之一。王慧敏等[31]在牛组织中MBD1基因表达及其DNA甲基化调节的研究中发现, 在牛的5种组织中, MBD1基因在心脏和肾脏的表达量低于肝脏、睾丸及卵巢, 且差异显着 (P<0.05) ;DNA甲基化检测显示, 心脏和肾脏MBD1调节区的甲基化比率较肝脏、睾丸及卵巢甲基化低, 说明调控区DNA甲基化与MBD1基因的组织特异性表达相关。王梦楠等[32]分析了牛Ascl2基因印记及DNA甲基化状态, 结果表明, Ascl2基因启动子区DNA的甲基化修饰调控Ascl2基因的印记表达。Liu等[33]通过探求转基因克隆牛的死亡是否与其胎盘中印迹基因的甲基化水平相关发现, PEG10基因在早期流产克隆牛胎儿的皮肤组织中表现异常的DNA甲基化水平。S.K.Liu[34]报道了DAZL基因mRNA表达水平和甲基化水平发现, 其甲基化和mRNA表达水平呈显着负相关, DAZL基因的甲基化对该基因的转录调控起着重要的作用, 可能影响牦牛精子的生成。奥旭东等[35]研究了牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化, 认为牛卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程, 其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关, 胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关。张明月等[36]对PEG11基因在体细胞核移植牛中印迹和DNA甲基化状态进行了分析, 发现PEG11基因在新生死亡SCNT牛肺脏中印记紊乱可能是导致SCNT牛肺脏发育缺陷的原因之一, PEG11基因内部CGIs的甲基化不参与调控PEG11基因的基因组印记。liu等[37]对牛背最长肌、肩胛肌、臀肌及肋间肌中的lncRNA进行测序分析, 共鉴定得到7 188个lncRNAs, 通过分析发现, 牛骨骼肌中的lncRNAs的特征在很多方面与已知的其他哺乳动物中的lncRNAs类似, 表达水平比mRNA表达水平低等现象。上述的研究也为后续利用表观遗传技术进行牛育种改良提供了良好的基础。

　　1.3 表观遗传学相关技术在羊遗传育种上的应用

　　与其他畜种相比, 表观遗传学技术在的羊遗传育种方面的研究起步较晚, 在DNA甲基化方面, 陈琦等[38]对多脊椎蒙古羊Hoxc8 exon-1的甲基化进行了分析, 发现Hoxc8exon-1的甲基化DNA可以作为多脊椎蒙古羊早期选种的DNA分子标记。赵静等[39]对绵羊HOXC8基因的DNA甲基化研究, 发现蒙古羊14枚胸椎个体的甲基化程度高于13枚胸椎个体。蒙古羊甲基化程度普遍高于外国品种。蒙古羊特有的可遗传甲基化位点共有6个 (5, 69, 1, 62, 6, 27) , 而国外品种在这些位置不发生甲基化。并且这6个位点的甲基化程度高低可能决定了第14枚胸椎的长短和骨化程度。姚力丹等[40]对新疆巴什拜羊肌肉生长抑制素基因DNA甲基化与mRNA表达量进行了分析, 发现肌肉组织甲基化概率高于脂肪组织, 其中, 股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂的甲基化概率分别为74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%, MSTN基因在股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌中的表达水平显着低于尾脂 (P<0.05) , 股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌之间差异不显着 (P>0.05) , 巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因DNA甲基化水平与MSTN基因表达量呈显着负相关 (r=-0.886, P<0.05) 。何晓龙等[41]对乌珠穆沁羊不同组织基因组DNA甲基化状态的MSAP进行了分析, 发现脾脏组织的甲基化程度最高, 肌肉组织的甲基化程度最低。郭海燕等[42]对长江三角洲白山羊优质笔料毛关键基因CMTM3启动子区甲基化进行了分析, 发现CMTM3基因的甲基化水平与其表达量呈负相关, 相关性达显着或极显着水平, 提示CMTM3基因参与了优质笔料毛性状的形成过程。Byrne等[43]利用染色质免疫共沉淀测序技术绘制出了妊娠后期绵羊胎儿及出生后12周龄的腰部骨骼肌的H3K7me3修饰图谱, 发现在这两个阶段, 骨骼肌的H3K7me3主要修饰基因的编码区、转录起始位点及Cp G岛, 并于基因的转录沉默密切相关。Couldrey等[44]通过限制性内切酶重亚硫酸盐测序 (RRBS) 技术研究了绵羊背最长肌全基因组DNA甲基化模式, 分析其与其他物种有许多相似之处, 转录起始位点 (TSS) 附近的DNA甲基化模式呈现倒“几”字型, TSS附近的DNA甲基化水平最低, 而基因表达与DNA甲基化正好相反, 表明DNA甲基化与绵羊肌肉生长与发育相关基因的表达呈负相关。Lin等[45]从miRNA调控角度出发, 研究了泌乳期山羊乳腺组织中高表达的miRNA及其功能, 结果发现了30个高表达miRNA。其中的miR-103不仅与山羊泌乳性能相关, 其在乳腺上皮细胞中过表达时, 可显着上调乳脂合成基因的表达, 并促进脂滴形成和甘油三酯合成、提高不饱和脂肪酸的比例。该研究表明, miR-103的表达与山羊奶中乳脂的生成密切相关。在羊育种中, 导入表观遗传因子或选择有利基因型可提高群体的生产性能。

　　1.4 表观遗传学相关技术在鸡遗传育种上的应用

　　表观遗传学技术在鸡上的研究大多集中在性别控制的表观遗传修饰方面, 但也有与抗病育种及肉质等方面的相关研究。任晓明等[46]对马立克氏病毒DNA转录区和非转录区甲基化及脱甲基化进行了探讨, 用Suothern斑点分子杂交放射自显影等方法, 验证了MDCC MSB 1等细胞株DNA的转录区和非转录区都存在着甲基化现象。转录区甲基化程度高于非转录区。用5氮胞苷可以阻断DNA甲基化, 阻断效果在转录区最好。班谦等[47]对家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP进行了检测, 发现鸡胚发育过程, DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。李宁等[48]对以红色原鸡和茶花鸡为例, 对鸡的全基因组DNA甲基化分布及其与基因表达水平的关系进行了研究, 初步探讨了鸡的全基因组表观型的进化和选择进展。王娟等[49]研究了不同培养条件对鸡胚胎生殖细胞Oct4启动子DNA甲基化的影响, 发现在改良培养条件下, Oct4基因启动子DNA甲基化程度较低, 且与基因表达水平呈负相关, 更有利于维持胚胎生殖细胞的自我更新状态。孟纪伦等[50]对感染禽流感病毒SPF鸡与SPF鸡心脏和肺脏全基因组DNA甲基化差异进行了分析, 揭示了禽流感病毒感染过程中H5N1对宿主 (鸡) 不同组织全基因组甲基化水平的影响, 为家禽抗病性状的分子机制研究提供了理论依据。李金龙等[51]对北京油鸡肌肉和卵巢组织基因组DNA甲基化状态检测与分析, 发现北京油鸡肌肉和卵巢组织的基因组DNA的甲基化状态存在差异, 而肌肉组织的甲基化状态对北京油鸡的体重具有重要作用。陈静等[52]对鸡不同生精细胞中Piwil1基因启动子区DNA甲基化差异进行了研究, 发现在+105~+252 bp非编码区域甲基化可能对Piwil1基因转录调控有一定影响。李世召等[53]用高效液相色谱法检测鸡胚组织基因组DNA甲基化水平变化规律, 发现随着鸡胚发育的进行, 基因组DNA甲基化水平逐渐升高, 且在胚胎发育后期肝脏甲基化水平较高。张天目等[54]分析了高、低脂鸡腹部脂肪组织DNA甲基化的差异, 发现DNA甲基化调控鸡脂肪组织生长发育, DNA甲基化差异可能是高、低脂鸡腹脂性状差异的原因之一。宋鹤等[55]对DNA甲基化酶抑制剂对鸡脂肪发育相关基因表达的影响进行了研究, 发现甲基化酶抑制剂处理均不同程度地提高了PPAR、C/EBPB、HOPX、KLF7、A-FABP基因的表达, 提示DNA甲基化参与鸡脂肪组织生长发育的调控。Darnell等[56]首次通过高通量方法检测了鸡胚胎发育期间的miRNA表达, 找到了135个miRNA靶基因, 其中早期胚胎发育共检测到84个基因, 并且许多miRNA表现出组织和细胞时空特异性。Tian等[57]、Lian等[58]和He等[59]从miRNA及linRNA调控角度, 研究了鸡马立克氏病的抗病机制, 获得了gga-miR-15b、gga-miR-181a及lincsatbi等有重要调控作用的miRNA及受其调控的靶基因ATF2、MYBL1、SATB1等。Zhang等[60]研究了DNA甲基化与三黄鸡肉质性状之间的相关性, 发现DNA甲基化差异显着影响三黄鸡肌肉纤维密度和滴水损失, 从而影响三黄鸡的肉质。Gao等[61]对鸡脂肪组织CCAAT增强子结合蛋白α基因 (CCAAT/enhancer-binding proteinα, CEB-PA) 启动子区Cp G位点的DNA甲基化进行研究, 发现2、3和7周龄低脂肪系肉鸡的CEBPA基因启动子区DNA甲基化显着高于高脂肪系肉鸡, 相应地, 2周龄低脂肪系肉鸡CEBPA基因表达水平显着低于高脂肪系肉鸡。说明脂肪组织CEBPA基因甲基化可能调控鸡的脂肪沉积。

　　2 表观遗传学相关技术在家养动物遗传育种应用的前景与措施

　　2.1 应用表观遗传学技术培育优良新品种 (系)

　　动物优良新品种 (系) 培育一般通过品种间杂交与横交固定创制的或通过本品种选育完成的, 但常规育种方法周期较长, 遗传进展缓慢, 尤其是需要数量规模较大的基础群, 花费的人力物力较大。近年来兴起的动物转基因育种技术可实现对目标性状的定向变异和定向选择, 大大提高选择效应, 加快育种进程, 但在技术上较为复杂, 效率较低, 舆论压力较大。与转基因育种相比, 作为不改变DNA序列的第二代基因修饰技术, 表观遗传修饰可以避免舆论的反感, 而且使得转基因动物性状的产生更加精确、迅速、高效。但是, 表观遗传技术应用于动物优良新品种 (系) 的培育中的前提是阐明重要经济性状形成的表观遗传基础, 尤其是需要鉴定出影响重要经济性状 (和其主效基因) 的表观遗传修饰因子。因此, 急需制定出适合于动物优良新品种 (系) 培育过程中表观基因组学操作技术和育种技术运用的国家层面的规范。

　　2.2 应用表观遗传学技术提高家养动物的繁殖效率

　　家养动物中的牛羊等反刍家畜, 基本上以产单胎为主, 特别是绵、山羊还存在季节性发情的现象。而近几十年来, 同期发情、超数排卵、体外受精、显微授精和胚胎移植等繁殖新技术的运用, 虽然提高了动物的繁殖效率, 但这些繁殖技术均人为地干扰了动物正常的生殖过程, 如超数排卵可能干扰了卵泡发育进程, 而体外受精技术则绕过了正常受精和卵子激活的过程, 这些繁殖新技术的共性是均可引起靶细胞表观遗传修饰的改变。因此, 揭示动物正常生殖过程的表观遗传基础, 通过了解繁殖新技术诱导的表观遗传修饰的改变, 不仅可为繁殖新技术的应用提供实践指导, 还可将表观遗传修饰技术和繁殖新技术有机结合, 更高效、更精确地提高家养动物的繁殖效率。

　　2.3 应用表观遗传技术加快克隆胚胎生产和实现转基因动物新品种培育

　　家养动物的繁殖性状大多属于低繁殖力性状, 并且很多性状间呈负遗传相关 (如羊毛的纤维直径与产毛量) , 因此, 利用传统的常规育种技术手段很难获得兼有2个优良性状的个体, 但转基因技术则可彻底打破常规育种中这种技术屏障。虽然转基因动物生产已经取得了技术上的突破, 但普遍存在克隆胚胎器官发育缺陷、死亡、转基因动物流产、夭折、畸形、早衰以及克隆基因表达效率低下、沉默等问题, 这些问题均与表观遗传学修饰有关。因此, 如何利用表观遗传学相关技术揭示转基因动物生产中上述问题形成的机制, 并将表观遗传修饰技术与其他新技术有机结合, 可有效地提高克隆胚胎的发育率、转基因动物的出生率、存活率, 实现靶基因高效表达、转基因动物高效生产, 加速转基因动物新品种培育。

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