环状RNA的分子特性、功能及其组织修复研究进展

　　摘    要：　背景：环状RNA是一种非编码RNA，通过反式剪接使3’端和5’端以共价键相连接形成1个闭合环状结构。环状RNA广泛存在于多种生物细胞中，具有结构稳定、序列保守、来源丰富等特征。目前研究表明环状RNA可通过多种途径发挥作用。目的：该文就环状RNA的分类及形成过程、分子特性、功能及其在组织损伤修复中的作用做一综述。方法：第一作者应用计算机检索2005年1月至2019年4月PubMed数据库、中国期刊全文数据库关于环状RNA的文章，英文检索词“circR NA,function,miRNA,injury”；中文检索词“circR NA，功能，miRNA，损伤”。对纳入的39篇文献进行分析讨论。结果与结论：(1)目前发现的环状RNA根据其来源可分为4类：外显子来源的环状RNA(exonic circRNA)、外显子及内含子共同组成的环状RNA(EliRNA)、内含子来源的环状RNA(ciRNA)和聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的转录通读形成的通读环状RNA(rt-circRNA);(2)环状RNA具有丰富性、保守性、稳定性；(3)越来越多的研究表明环状RNA具有多种功能：海绵吸附功能、与蛋白相互作用、调节转录、参与蛋白翻译；(4)大量研究表明环状RNA参与组织修复，其表达特征与组织修复具有明显相关性。

　　关键词：　circRNA; miRNA; 环状RNA; 组织损伤; 组织修复;

　　Abstract：　BACKGROUND: Circular RNA(circRNA) is a new endogenous non-coding RNA produced by the RNA shearing process. It has a closed loop structure, without 3' cap and 5' poly(A) tail. circRNA is widely distributed in eukaryotes, and has the characteristics of stable structure, evolutionary conservation, and abundant sources. Current research has shown that circRNA can function through diversified ways. OBJECTIVE: To review the classification and formation process of circRNA, its molecular properties, potential functions and its role in tissue repair.METHODS: A computer-based search for literature in CNKI and PubMed databases published from January 2005 to April 2019 was performed using the keywords of “circRNA, function, miRNA, injury” in English and Chinese, respectively. Finally, 39 articles were included for analysis. RESULTS AND CONCLUSION: Currently discovered circRNAs can be classified into four types according to their origins: exon-derived circRNA(exonic circRNA), exon-intron circRNA(EliRNA), intron-derived circRNA(ciRNA) and read-through circRNA(rt-circRNA). circRNA is rich, conservative and stable. Increasing studies have shown that circRNA has multiple functions, but mainly has the following four functions: sponge adsorption function, interaction with proteins, regulation of transcription, and participation in protein translation. Numerous studies have shown that circular RNA is involved in the regulation of tissue repair, and its expression profile is significantly related to tissue repair.

　　Keyword：　circRNA; miRNA; circular RNA; tissue injury; tissue repair;
 

 

　　文章快速阅读：

　　文章描述—

　　(1)环状RNA是一种环状小分子RNA，在组织修复中起着重要的作用；

　　(2)环状RNA的研究热点集中于调控下游蛋白的表达及作为内源竞争性RNA充当miRNA海绵；

　　(3)环状RNA有望成为疾病诊断的生物标志物或治疗的靶点。

　　文题释义：

　　环状RNA：是一种新的内源性非编码RNA，产生于RNA剪切过程，无3’帽子结构和5’poly尾，呈闭合环状，可作为上游靶点调控mi RNA从而起到调控组织修复的作用。

　　环状RNA的主要功能：(1)作为内源竞争性RNA充当mi RNA海绵；(2)环状RNA与蛋白相互作用可参与多种生理活动的调控；(3)调节转录；(4)参与蛋白翻译。

　　0 . 引言Introduction

　　环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新的内源性非编码RNA，产生于RNA剪切过程，呈闭合环状，无3’帽子结构和5’poly尾，广泛存在于真核细胞中，具有稳定性、进化保守性[1,2,3]。随着二代测序技术和生物信息学的快速发展，环状RNA逐渐被研究者们所了解。研究表明，环状RNA参与细胞内RNA调控网络，其表达变化与疾病的发生、发展有密切关联。

　　1、 资料和方法Data and methods

　　1.1 、资料来源

　　由第一作者检索2005年1月至2019年4月PubMed数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)及CNKI中国期刊全文数据库(http://www.cnki.net/)，以“CircRNA,function,miRNA,injury”为英文检索词，“CircRNA，环状RNA，功能，miRNA，损伤”为中文检索词，检索摘要中同时包含上述检索词的文献，总计中英文文献共95篇。

　　1.2、 入选标准

　　纳入所有国内外公开发表关于环状RNA的文章，包括综述、论着等。排除重复性研究。

　　1.3、数据的提取

　　计算机初检得到95篇文献，阅读标题和摘要进行初筛，排除重复报道的文献以及与环状RNA不相关的文献。纳入符合标准的39篇文献进行分析。

　　2、 结果Results

　　2.1、 环状RNA的分类及形成机制

　　目前发现的环状RNA根据其来源可分为4类：外显子来源的环状RNA(exonic circRNA)、外显子及内含子共同组成的环状RNA(exon-intron circRNA,ElciRNA)[4]、内含子来源的环状RNA(circular intronic RNA,ciRNA)和通读环状RNA(read-through circRNA,rt-circRNA)[2]。

　　2.1.1、 外显子来源的环状RNA和外显子及内含子共同组成的环状RNA

　　“内含子配对驱动的环化”和“外显子跳跃”+“套索驱动的环化”是产生这2种环状RNA的机制：(1)位于外显子2和外显子3侧翼的内含子之间存在互补序列，其环化成环直接通过碱基相互配对形成，最终产生外显子来源的环状RNA或外显子及内含子共同组成的环状RNA;(2)前体RNA发生部分折叠从而使得外显子1的3’端剪接配体与外显子4的5’端剪接受体共价结合，进而形成一个包含外显子2及外显子3的套索结构，最终环化产生外显子来源的环状RNA或外显子及内含子共同组成的环状RNA，见图1[5]。

　　图1 外显子来源环状RNA和外显子及内含子共同组成环状RNA的产生机制

　　2.1.2、 内含子来源的环状RNA

　　内含子来源的环状RNA分为Ⅰ类和Ⅱ类。Ⅰ类内含子来源的环状RNA的形成：结合在内含子上的一个外源鸟苷(exo G)攻击5’剪接位点，在第1次反应中5’外显子被切除，并且exo G与内含子变成线性连接，随后5'外显子末端的3’羟基基团攻击3’剪接位点，2个相邻的外显子相连接同时线性RNA被释放，线性内含子通过末端鸟苷(ωG)的2’-OH基团亲核攻击结合靠近3’末端的磷酸二酯键最终环化成RNA的同时释放出1个3’端尾[6]。Ⅱ类内含子来源的环状RNA的形成：环化形成需要3’端外显子的释放。内含子末端2’-OH基团攻击5’碱基位点，伴随着2’,5’磷酸二酯键形成，产生1个环状RNA和1个5’的外显子，见图2[7]。

　　图2 内含子来源环状RNA的产生机制

　　2.1.3、 聚合酶Ⅱ(PolⅡ)转录通读形成的通读环状RNA

　　陈玲玲课题组[8]利用4sUDRB纯化新生转录本技术，通过监测环形RNA生成与RNA聚合酶Ⅱ转录的动态偶联过程，首次证实细胞内反向剪接RNA成环与顺序剪接相比发生效率非常低，大多数RNA成环发生在转录后水平；能够发生RNA成环的基因较非成环的基因转录速度更快，这一研究结果提示外显子RNA成环效率与其所在基因的RNA聚合酶Ⅱ转录速度相偶联。

　　2.2、环状RNA的分子特性

　　2.2.1 、丰富性

　　随着高通量测序技术的发展，环状RNA已在不同的细胞类型和物种间检测到[9]。研究发现有5.8%-23%的人类基因积极活跃转录产生环状RNA，这些环状RNA在组织和细胞间起着动态平衡作用[10,11]。MEMCZAK等[1]在CD19+、CD34+、HEK293、Neutrophil细胞系中发现2 487种环状RNA。SALZMAN[12]在人神经母细胞瘤细胞中发现4 264种环状RNA。RYBAK-WOLF等[13]在小鼠的胚胎干细胞中发现761种环状RNA。

　　2.2.2、 稳定性

　　因为环状RNA的特殊结构，使其能够抵抗核糖核酸酶或核酸外切酶的降解。ZHENG等[14]对类风湿性关节炎患者和健康人血液中的单核细胞进行环状RNA表达谱分析，发现在患者和健康者中有584种显着差异的环状RNA。WU等[15]对高血压患者和健康者血浆进行了环状RNA表达谱的分析，发现有46个显着上调的环状RNA和13个显着下调的环状RNA。由于体液中含有大量的核酸酶，这些环状RNA的发现无疑证实了它的稳定性。

　　2.2.3 、保守性

　　环状RNA在不同物种间也具有高度的进化保守性。在人和小鼠中有4%来自直系同源基因。在这些环状RNA中有5%-30%是完全保守的[16]。此外，在人脑中表达的环状RNA有5%-10%同样在猪脑中表达[17,18]。在大鼠和小鼠这类物种间环状RNA的保守性可高达23%[19]。哺乳动物中环状RNA的表达是相对保守的，尤其在哺乳动物的大脑组织中环状RNA保守性最高[17]。

　　2.3、 环状RNA的主要功能

　　越来越多的研究表明环状RNA具有多种功能，但主要有以下4个功能。

　　2.3.1、 作为内源竞争性RNA充当mi RNA海绵

　　充当miRNA的海绵功能是目前对环状RNA研究比较深入的方向之一，也是环状RNA较为普遍的作用。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。mi RNA可与靶基因m RNA的3'UTR相结合，起到降解或抑制m RNA翻译的作用。在宫颈癌组织中高表达的circ RNA-000284可以通过吸附mi R-506进而促进癌细胞增殖、迁移和侵袭[20]。JOST等[21]成功构建了人工环状RNA分子，可以吸附丙肝细胞中的mi R-122，进而阻止HCV病毒蛋白形成，缓解丙型肝炎。

　　2.3.2 、与蛋白相互作用

　　环状RNA与蛋白相互作用可参与多种生理活动的调控。(1)环状RNA与蛋白相互作用可实现对蛋白的调控。例如circ-FOXO3可与双微体2蛋白(Murine Double Minute 2,MDM2)和P53相互作用，促进MDM2介导的P53蛋白的泛素化[22];(2)环状RNA与蛋白的相互作用也可动态调控环状RNA的形成等过程。例如环状RNA与QKI或MBL的相互作用影响了环状RNA的形成过程。当MBI蛋白过量时，它会促进环状RNA circMBI的产生来降低自身的mRNA产量从而起到动态平衡的作用。

　　2.3.3、 调节转录

　　非编码RNA可调节亲本基因的表达。研究显示内含子来源的环状RNA主要通过与RNA聚合酶Ⅱ复合体(polⅡ)结合促进基因转录。环状RNA ci-ankrd52来源于ANKRD52基因第2个内含子区域并积聚在细胞核中，ci-ankrd52干扰polⅡ的延伸并作为polⅡ的正调控因子从而起到亲本基因的顺式调节作用[2]。

　　2.3.4、参与蛋白翻译

　　LEGNINI等[23]发现环状RNAcirc-ZNF609可直接翻译蛋白并参与肌肉发生过程，他们对小鼠和人成肌细胞体外分化模型及杜氏肌营养不良疾病模型进行了环状RNA表达谱分析，根据功能及表达情况，最终选择了与肌肉发生功能相关的环状RNAcirc-ZNF609。基于蛋白组学分析和Western验证，证明了内源性circ-ZNF609的蛋白翻译功能。PAMUDURTI等[24]在果蝇的大脑组织中发现部分环状RNA可以结合到核糖体上并经过一系列的研究证实部分环状RNA可翻译蛋白。现在已经有越来越多的实验直接或间接证实环状RNA具有翻译的功能。

　　2.4、环状RNA在组织修复过程中作用的研究进展

　　2.4.1 、肝脏疾病

　　ZHOU等[25]发现mmu-circ-34116在小鼠肝纤维化模型中是显着上调的，敲低mmu-circ-34116后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达显着增加，增加肝纤维化的进展。OU等[26]对非酒精性脂肪性肝炎的小鼠肝脏组织进行了环状谱的全面分析，研究发现共有450个环状RNA表达失调，298个环状RNA表达上调，152个环状RNA表达下调，其中circ-29981被鉴定为一种显着差异表达的环状RNA。circRNA-miRNA通路相互作用分析结果显示circRNA-29981是肝星状细胞激活的潜在调节因子，肝星状细胞是肝纤维化的主要细胞类型。ZHU等[27]发现在LX-2细胞中circ-0067835的表达显着增加，敲除circ-0067835后LX-2细胞增殖明显下降，导致G1停滞，并促进凋亡，进一步的实验发现circ-0067835通过充当mir-155的海绵来促进foxo3a的表达来调节肝纤维化的进展，circ-0067835可作为肝纤维化患者的潜在治疗靶点。

　　2.4.2 、肾脏疾病

　　氯沙坦对急性肾损伤有抑制作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。为了解氯沙坦对急性肾损伤的治疗作用，FANG等[28]通过缺血再灌注法建立大鼠急性肾损伤模型，发现大鼠缺血再灌注肾脏中存在广泛差异表达的环状RNA,circ-DNMT3A、circ-AKT3、circ-PLEKHA7和circ-ME1在急性肾损伤大鼠中表达量显着下调，而经氯沙坦预处理后的急性肾损伤大鼠中这几种环状RNA的表达量可恢复。虽然这几种环状RNA的具体作用机制不明确，但一系列研究显示这些环状RNA在急性肾损伤中起着重要的作用。K?LLING等[29]发现肾损伤患者血液中的ci Rs-126表达呈现显着上调，ci Rs-126可作为mi R-126的海绵吸附体，而mi R-126已被证实可以维持缺氧状态下内皮细胞的稳定性，故敲低ci Rs-126后可上调mi R-126的表达从而起到保护肾脏的作用。

　　2.4.3、 心血管疾病

　　最新的研究发现环状RNA ACR通过调节PINK1/FAM65B通路抑制自噬，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，ACR通过直接与dnmt3b结合并阻断dnmt3b介导的pink1启动子的DNA甲基化来激活pink1表达，PINK1可抑制自噬，在PINK1转基因小鼠中发现心肌梗死灶缩小。pink1可继续调控下游靶基因fam65b，而磷酸化FAM65B抑制心脏自噬和细胞死亡[30]。有研究表明在心肌纤维化的小鼠模型中circ-000203的表达显着上调，进一步研究显示上调的circ-000203可吸附miR-26b-5p，从而解除mi R-26b-5p对心肌成纤维细胞中纤维化基因(如Col1a2、CTGF)的抑制作用，最终加速心肌纤维化[31]。circRNA HRCR可作为mi R-223的海绵体，抑制mi R-223对含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)的正向调控作用，来减缓心力衰竭[32]。

　　2.4.4、周围神经损伤

　　ZHOU等[33]研究发现circ RNA-2837在大鼠坐骨神经损伤模型中是显着下调的，下调circ RNA-2837后可诱导体内自噬减轻坐骨神经损伤。下调circ RNA-2837后检测自噬相关蛋白LC3-II和p62，发现二者呈现负相关状态，这一研究验证了其通过自噬发挥作用。CAO等[34]发现circ-013779,circ-008008,circ-003724在大鼠坐骨神经慢性损伤模型中存在显着差异，这一发现提示研究这几种环状RNA可能在坐骨神经治疗中起着重要的作用，具体机制有待进一步研究。

　　2.4.5、牙周组织

　　GU等[35]研究发现CDR1as在牙周韧带干细胞成骨分化中起着重要的作用。在成骨分化过程中CDR1A显着上调，而MIR-7显着下调。作为一种mir-7抑制剂，触发了gdf5上调和随后的smad1/5/8、p38-mapk磷酸化以促进成骨分化。该研究提供了对成骨分化机制的新理解，并提出了促进骨形成的一种潜在方法。牙周韧带干细胞在成骨培养基中培养第0,3,7,14天这4个时间点观察环状RNA表达谱的变化，研究发现在第3天有118个环状RNA表达差异，在第7天有128个环状RNA表达差异，在第14天有139个环状RNA表达差异。在胞质或膜结合囊泡和细胞外基质中，差异表达的环状RNA的宿主基因丰富，表明它们调节细胞外囊泡的生物发生具有潜在作用[36]。

　　2.4.6、 其他

　　HUANG等[37]对处理和未处理的缺血再灌注小鼠小肠进行环状RNA表达谱的分析，发现circ-012412和circ-016863在未处理的缺血再灌注小鼠小肠中显着下调，而在处理的缺血再灌注小肠中显着上调。由此推测这2种环状RNA可能是防止肠道缺血再灌注损伤的保护因素。SONG等[38]对椎间盘退变中的髓核组织进行高通量测序，发现circ-104670在椎间盘退变中的髓核组织高表达。干扰circ-104670可抑制髓核细胞的凋亡，并可吸附mi R-17-3p调控下游MMP-2表达。由此推断circ-104670在椎间盘退变中起关键作用，抑制椎间盘的退变。课题组用人脐带间充质干细胞修复损伤的子宫内膜间质细胞，在子宫内膜间质细胞中发现大量差异表达的环状RNA，其中circ-0111659表达显着上调，生物信息学分析发现与之结合的miR-17-5p/20b-5p/93-5p与VEGF均有结合位点。由此推测circ-0111659可通过miR-17-5p/20b-5p/93-5p调控VEGF的表达起到修复损伤内膜的作用[39]。以上大量研究证实circRNA在组织修复中有重要作用，见表1。

　　表1 circRNA在各种组织修复中的表达

　　3 、总结和展望Conclusions and prospects

　　目前对环状RNA的研究还处于起步阶段，尚有许多问题有待研究，如环状RNA是通过何种机制抵抗RNA酶的降解；环状RNA的形成与其前体RNA剪接是通过何种机制处于动态平衡状态；环状RNA是通过何种机制降解等。目前环状RNA在肿瘤疾病的研究比较深入，大量的环状RNA已被确定为肿瘤的标志物，但环状RNA在组织损伤修复中的研究相对较少，以上研究表明环状RNA参与组织修复，其表达特征与组织修复具有明显相关性。环状RNA在组织损伤修复中的具体分子机制没有完全被阐释，现有的研究显示环状RNA/Mi RNA轴可能起着重要的作用。随着深入研究，环状RNA在组织损伤修复中的具体机制被人们所了解，为环状RNA过渡到临床打下基础。

　　作者贡献：所有作者构思并设计此综述，第一作者完成资料收集并撰写，通讯作者审校。

　　经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81771527)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

　　利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

　　写作指南：该研究遵守《系统综述和荟萃分析报告规范》(PRISMA指南)。

　　文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

　　文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

　　文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

　　开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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