果蝇miRNA的结构与作用机制及生物功能

　　miRNA( microRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为21 个核苷酸( nucleotide，nt) 的非编码单链 RNA 分子，由具有发夹结构的 70 ～90 个碱基大小的单链 RNA 前体经过核酸酶加工生成，其本身不具有开放阅读框架( ORF) 。越来越多的研究表明非编码 RNA 对真核生物基因的表达起重要的调控作用。miRNA 通过与靶标基因的 mRNA 的特定结合位点结合，诱导该 mRNA 的降解或者抑制该基因编码蛋白的合成，从而参与靶基因的表达调控( Kim et al.，2009) 。miRNA 在不同的模式生物中的研究都取得了一定进展，而果蝇 Dro-sophila 作为经典的模式生物，对其 miRNA 的研究近几年取得了相当成就。本文总结了 miRNA 的发现、果蝇 miRNA 作用机制，并对 miRNA 调控果蝇生长发育等各个阶段的分子机制研究进行综述。

　　1 miRNA 的发现

　　miRNA 最早于 1993 年在秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis el-egans 中发现并确定其结构，研究发现一种 22 nt 的 RNA 分子lin-4 在翻译水平上通过抑制一种核蛋白 lin-14 的表达来调控线虫的幼虫发育进程( Lee et al.，1993) 。此结果在当时被认为是偶然情况。直到发现第二个 miRNA let-7，存在于线虫幼虫时期的 L3 期、L4 期以及成虫期，与蜕皮激素相关( Rein-hart et al.，2000) 。此后，2001 年《Science》分别报道了三个实验室从线虫、果蝇和小鼠中克隆得到的几十个与 C. elegan的 miRNA lin-4 相类似的 miRNA( Lagos-Quintana et al.，2001;Lau et al.，2001; Lee & Ambros，2001) 。随着不同种类 miR-NA 的不断发现，研究者越来越认识到其在转录后调控中的重要作用，miRNA 逐渐成为现代分子遗传学的研究热点之一。

　　2 果蝇 miRNA 的结构与作用机制

　　2. 1 果蝇 miRNA 的形成
　　果蝇 miRNA 是一组长度为20 ～24 nt 的不编码蛋白质的短序列 RNA，但在3' 端可以有 l ～2 nt 的长度变化，其本身不具有开放阅读框架( ORF) ，可通过 Northern 印迹检测。果蝇miRNA 的合成包括转录、加工成熟 2 个主要步骤。转录过程发生在果蝇细胞核中，其 miRNA 基因被转录生成长度为几百到几千核苷酸的具有发卡结构的双链 miRNA，即初级 miR-NA( primer miRNA，pri-miRNA) ( Hutvágner ＆ Zamore，2002;Ventura et al.，2008) ; 果蝇 miRNA 的加工成熟过程分为细胞核加工和细胞质加工，这一过程是通过 RNaseⅢ家族的 pasha剪切 pri-miRNA 双链形成 60 ～70 nt 的前体 miRNA( precursormiRNA，pre-miRNA) ，pre-miRNA 再与转运蛋白 Exportin-5 结合由细胞核内转移到细胞质中，这一转移过程需要 GTP 供能，进一步 Dicer 酶剪切 pre-miRNA 形成约 23 nt 的成熟miRNA。

　　2. 2 miRNA 的作用机制
　　果蝇成熟的 miRNA 序列很快被引导进入蛋白质中形成miRNA 诱导的沉默复合体 miRISC( miRNA-induced silencingcomplex) ( Han et al.，2009) ，miRISC 再通过 miRNA 中长度约8 nt 的保守序列与靶标 mRNA 3'UTR 区域结合位点的碱基互补，从而识别靶标基因并调控其表达( Krol et al.，2010) 。

　　miRNA 在生物体内可以以单体形式存在，也可以簇集的形式存在，这些成簇分布的 miRNA 通常协同表达。近年来在果蝇中发现集群存在的 miRNA 形成类似的发卡结构串连在一起形成一个新的结构，这些 miRNA 通常是相关功能的结构。例如在果蝇中，miR-12、miR-283、miR-304 成簇存在于果蝇胚胎发育过程中，协同控制 Hedgehog 信号途径，以及 miR-310s 家族协同调控胚胎的体轴的形成，从而保证果蝇胚胎发育正常有序的进行( Marco et al.，2013) 。

　　miRNA 在动物体内与靶基因 mRNA 的 3'UTR 序列不完全配对，但在植物中能够与靶基因 mRNA 的 3'UTR 完全配对，miRNA 无论与 mRNA 是否能完全配对，都能够抑制靶mRNA 的翻译或致使 mRNA 的降解( Lelandais-Brière et al.，2010) 。miRNA 主要与靶标 mRNA 的 3'UTR 区域的结合位点结合，但在 mRNA 的编码区和 5'UTR 也有很多 miRNA 的结合位点，二者相比 miRNA 与靶标 mRNA 的编码区和 5'UTR的结合能力较弱，因此对靶基因的表达抑制程度较弱( Yu etal.，2007; Moretti et al.，2010) 。例如 Moretti 等( 2010) 研究确认了果蝇的 miR-2 可通过与靶 mRNA 5'UTR 和编码区结合也可抑制靶基因的表达。miRNA 的调控机制复杂，并非一一对应关系，一个 miRNA 可能参与调控多个靶基因的表达，而一个靶基因的表达也可能由多个 miRNA 协同调控，数量众多的 miRNA 与靶基因之间形成了一个错综复杂的基因表达调控网( Legeai et al.，2010) 。

　　2. 3 果蝇 miRNA 的特点
　　果蝇 miRNA 在不同组织、不同发育阶段中的表达水平有显着差异，在功能和进化上具有高度保守性。例如 miR-3～ miR-7 只出现在果蝇早期胚胎时期，miR-12、miR-1 随果蝇生长含量增加，在成虫时含量较多，而 miR-9 及 miR-11 正相反，这表明 miRNA 具有时序性( Lagos-Quintana et al.，2001) 。

　　人 miR-9、小鼠 miR-9 和果蝇 miR-9a 相比较，三者 miRNA 的成熟序列完全相同，其功能也具有相似性都对神经系统的发育有重要调控作用，表明 miRNA 具有结构和功能上的保守性( Li et al.，2006) 。而某些 miRNA 可能只在一些特定分化阶段的特殊细胞中表达，例如 Kadener 等( 2009) 从果蝇头部细胞中鉴定出调控昼夜节律 miRNA bantam 其靶基因为 clock，但目前研究表明其只能在头部细胞中和靶 mRNA 结合，表明miRNA 具有组织特异性。综上所述果蝇 miRNA 具有时序性、保守性以及组织特异性等特点。

　　3 果蝇 miRNA 的生物功能

　　目前通过直接克隆法和生物信息学技术已经在果蝇中发现上百种 miRNA，大量研究证实，miRNA 几乎参与了果蝇生命过程中的所有重要环节，例如果蝇的胚胎发育、神经系统的发育、细胞凋亡、组织分化与形态发生等生物学过程。

　　3. 1 调节胚胎发育及细胞增殖
　　miRNA 具有调节果蝇胚胎发育的功能。在果蝇中对miRNA bantam 的研究比较透彻，miRNA bantam 是 21 碱基的miRNA，Brennecke 等( 2003) 通过利用 Gal4 系统对果蝇 miR-NA bantam 进行研究，发现 bantam 过表达会导致细胞数目增多，引起组织过度增生。研究表明其通过诱导果蝇细胞凋亡相关的 Hid 蛋白表达从而促进细胞增殖，miRNA bantam 不仅能够有效调控果蝇胚胎的细胞凋亡并促进细胞增殖，还能调控幼虫的脑发育和翅的分区( Brennecke et al.，2003) 。此外还发现 Hippo 信号途径可调控 bantam 的表达，已经知道 Hip-po 信号途径作用于 Yorkie 转录活化因子，而 Yorkie 能活化细胞周期 E( Cyclin E) 和细胞凋亡因子 DIAP1 从而调节果蝇的组织生长。Yorkie 能够促进 bantam 的表达，二者协同作用来控制果蝇的组织生长。

　　此外，果蝇 miRNA 通过参与 Wnt/Wingless( Wg) 信号通路对果蝇的发育进行调控。Wnt/Wg 信号通路包含多个正负调控因子，miR-315 通过抑制 Wg 信号通路中的负调控因子Axin、Notum 来参与对果蝇的体节极性基因 wg 的调控作用，( Silver et al.，2007) 。该 miRNA 调控果蝇胚轴的发育，对果蝇胚胎正常发育意义非凡。此外，miR-8 也被发现抑制 Wg信号通路，miR-8 含有多个靶标; 例如，两个正调控因子 Wnt-less 和 Wls、Wg 分泌的跨膜蛋白、锌指结构 CG32767 以及TCF 蛋白( Kennell et al.，2008) 。

　　Leaman 等( 2005) 在果蝇的胚胎发生过程中发现 miR-2、miR-6、miR-11 和 miR-13 等也能够调控细胞凋亡以保证果蝇在胚胎时期的正常发育，以及检测到 miR-3 至 miR-7 只出现在果蝇早期胚胎期，随着果蝇的生长发育逐渐消失( Stark etal.，2003) 。表明其对果蝇胚胎发育调控具有重要作用，同时也体现了 miRNA 在不同组织发育的不同时段调节基因表达，在进化上具有保守性，其具体调控机制目前不明确。

　　在果蝇胚胎期，miR-969 和 miR-9c 通过调控 5'-3' 核糖核酸外切酶控制核的分裂，当 miR-969 和 miR-9c 表达异常会导致原始生殖细胞( Primordial germ cell，PGC) 数目减少( Kugleret al.，2013a) 。研究还发现大量的 miRNA 存在于果蝇的生殖细胞系中，维持果蝇生殖干细胞的增殖。例如 miR-989 富集在卵巢中，其存在于卵室中控制细胞的迁移，miR-989 的异常表达会延迟卵室的形成及成熟，更甚则会导致卵室的畸形( Kugler et al.，2013b) 。

　　3. 2 调节神经系统发育
　　研究发现 miRNA 参与了神经系统发育的调控，例如miR-9a 存在于果蝇外周神经系统，参与果蝇神经系统的发育，miR-9a 缺失突变体导致果蝇感觉器官前体细胞( sensoryorgan precursors，SOPs) 发育异常或生成易位产物，而 miR-9a的过表达则会使 SOPs 严重缺失。该 miRNA 通过下调基因senseless 的表达来调控果蝇胚胎和成虫中感觉器官的精确数量以及翅的形成和细胞分区，基因 senseless 可控制 SOPs 的形成( Li et al.，2006) ; miR-9a 被猜测是通过抑制 senseless 的表达使非 SOPs 细胞向 SOPs 细胞的转化来控制神经细胞的数量。

　　Huang 等( 2013) 研究发现，miR-7 在调控果蝇的感觉器官发育过程中扮演了重要角色，其分布在果蝇胚胎的神经外胚层和成虫的复眼、腿与翅成虫盘中，该 miR-7 通过抑制Notch 信号途径中的关键基因 E( spl) 的表达，从而调节果蝇神经系统发育。此外，有研究表明 miR-7 可以调控基因 hairy的表达，果蝇 hairy 基因在周围神经系统的发育过程中能够抑制促神经基因的表达、限定刚毛的分布和定位感觉器官的发育，miR-7 异位表达会造成翅缘缺刻、刚毛密度变化等( Daet al.，2013) 。Xu 等( 2008) 发现果蝇 miR-124a 也可以调节树枝状感觉神经元分支数量，miR-124a 是中枢神经系统表达量最高的 miRNA，利用 GAL4/UAS 系统研究发现 miR-124a的过表达导致果蝇眼睛变小且复眼排列粗糙而不规则，反之其缺失果蝇会出现某种程度上运动能力的缺陷。

　　miR-8 调控靶标基因 atrophin 的表达来阻止神经退变的发生，miR-8 还参与细胞的生长增殖等，而且通过调控靶基因ush 可以调节果蝇的体型，当 miR-8 缺失时果蝇体型小，在脂肪体中胰岛素信号通路中有缺陷( Kennell et al.，2012) 。之所以产生这种缺陷是因为 miR-8 在果蝇幼虫脂肪体中抑制U-shapeed( Ush) 的表达，Ush 能够反向调控胰岛素信号通路从而调控细胞和个体生长发育。该过程中 Ush 激活 P13K 产生级联反应促进细胞的生长和增殖。此外 miR-8 还作用于Notch 信号通路的受体 Serrate ( ser ) 抑制 Notch 信号通路( Hyun et al.，2009) ，miR-8 的过表达还可以使生长异常并导致肿瘤的发生。在人体中发现的 miR-200 家族( miR-200a、b、c，miR-141 和 miR-429) 与果蝇 miR-8 同源，其中 miR-200c 和miR-141 阻碍人类前列腺癌细胞的扩散。miR-8 的作用机制不断深入研究为人类治疗癌症的过程提供了新的见解( Vallejo et al.，2011) 。

　　还有一些 miRNA 片段功能还在研究当中，目前有较新的研究表明果蝇 miR-276a 也被确认在脑细胞发育和嗅觉神经的发育中起重要作用( Wanhe et al.，2013) 。这些研究表明 miRNA 对果蝇的神经系统发育和调控有至关重要的意义。

　　3. 3 参与细胞凋亡
　　大量的研究表明 miRNA 参与细胞凋亡过程。Xu 等( 2003) 发现 miR-14 具有抑制细胞凋亡的作用，它的靶标基因是 caspase，利用基因敲除发现当 miR-14 缺失时果蝇会出现高死亡率，存活的果蝇对应激反应敏感、生存期缩短、复眼变小等，此外 miR-14 还与脂肪贮存有关。miR-14 还被发现通过调控 20-羟基蜕皮激素的信号通路参与调节果蝇的寿命，其与蜕皮激素受体( Ecdysone receptor，EcR) 结合进行调控( Varghese & Cohen，2007) 。在细胞凋亡过程中，促凋亡基因 reaper( rpr) 、head involution defective( hid) 等都参与调控。

　　研究发现在果蝇中 miR-263、miR-14 和 miR-2 家族都参与调控细胞凋亡，其中 miR-2 家族和 miR-11 通过作用于 dE2F1 可以抑制果蝇的胚胎凋亡使胚胎不能正常发育。E2F 转录因子是细胞周期的关键调控因子，而 dE2F1 为 E2F 家族成员之一，其在果蝇发育过程中表现出了时间和空间上特异性表达。此外 miR-6 被证明在果蝇胚胎发育过程通过调控 rpr、hid、grim 和 sickle 等基因的表达抑制细胞凋亡水平，研究还发现这些 miRNA 呈簇集分布，协同调节来发挥作用( Ge et al.，2012; Truscott et al.，2011) 。此外，miR-263a / b 在细胞凋亡过程也发挥重要作用，其通过下调 Hid 基因的表达来保证果蝇的正常发育。miR-263a 突变体出现了不同程度的小眼数减少、刚毛和感觉细胞缺失，这些 miRNA 参与细胞凋亡的调控，对果蝇正常的生长发育意义重大。在小鼠中发现与果蝇miR-263a / b 功能类似的 miR-183 家族，包括 miR-183、miR-96、miR-182 等这些 miRNA 成簇分布，这些 miRNA 缺失过表达可造成小鼠耳囊增生，反之其缺失会导致小鼠毛细胞退化和听力的损伤等发育缺陷( Lewis et al.，2009; Mencia et al.，2009) 。另外，miR-278 家族也有抑制凋亡的作用，它们的靶标基因 reaper 和 grin 等为促凋亡基因，miR-278 家族与靶标基因的 mRNA 结合抑制基因表达从而抑制凋亡发生( Stark etal.，2003) 。这些研究表明了 RNA 水平的细胞凋亡调控是由多种 miRNA 协同调控的过程，同时也体现了 miRNA 调控的复杂性。

　　3. 4 参与组织分化与形态发生
　　Hedgehog ( Hh) 信号通路在胚胎发育中细胞的生长分化、组织器官形成以及成体干细胞的维持和自稳态的保持等方面具有重要作用，hh 基因为重要的体节极性基因，对果蝇胚轴的正常发育意义重大。同时，Hedgehog 信号通路与 Wnt信号通路、Notch 信号通路等相互作用、密切联系，在肿瘤发生和发展过程起关键作用。在果蝇体内，Hh 配体和受体结合过程中，受到两个结合蛋白 Boi 和 iHog( Hh 干扰) 的调控，二者抑制该信号通路的传导。此外，Smoothened( Smo) 、Cos-tal-2( Cos-2) 和 Fused( Fu) 也构成了 Hh 信号通路的重要组成部分，其中 Smo 在促进肿瘤的发生过程有重要作用。在果蝇中，miR-932 通过对靶标基因 Boi 的调控来参与 Hh 信号通路，miR-932 过表达导致 Boi 蛋白与其 3'UTR 的结合抑制 Boi蛋白的作用来促进 Hh 信号强度，反之亦然。与此同时发现在果蝇翅成虫盘中 miR-932 过表达增加了 Hh 信号强度，但是减少了信号作用范围。此外通过计算机预测以及实验表明有更多的 miRNA 参与了 Hh 信号通路，但 miR-932 与 Boi蛋白的结合过程中表现出更强的活性( Gao et al.，2013b) 。

　　相反，miR-960 与 Smo、Cos-2 和 Fu 的 3'UTR 的结合抑制 Hh信号通路，但是其不能抑制 Wg 和 Dpp 的信号通路( Gao etal.，2013a) 。近年来还发现 miR-5 的 3'UTR 可以和 Smo 结合降低 Smo 的水平，其过表达抑制 Hh 通路，随着研究不断发现在哺乳动物癌细胞中 miR-256 以及 miR-326 等的 3'UTR 也被证实与 Smo 蛋白结合来抑制 Hh 信号通路( Ferretti et al.，2008; Wu et al.，2012) ，与此同时发现 miR-1、miR-283、miR-304 相互协调作用来抑制 Hh 信号通路( Friggi-Grelin et al.，2008) 。这些 miRNA 还被猜测参与多个信号通路，在发育过程中扮演重要角色，随着类似机制不断深入的研究，将会对miRNA 介导疾病发生的作用机制有新的认识。

　　miRNA 对果蝇组织分化的调控还体现在果蝇肌肉分化的过程，例如，miR-1 是一种进化上保守的 miRNA，在果蝇和小鼠中都存在，在果蝇肌肉和心脏中高度表达，通过对 Delta蛋白的作用控制果蝇肌肉分化，主要是控制果蝇肌肉细胞、心脏细胞的起源和分化，同时 miR-1 被确认在哺乳动物中对心肌细胞有增殖作用( Kwon et al.，2005) 。

　　除此之外有研究表明 miRNA 通过蜕皮激素和保幼激素的协同作用能够对果蝇的变态发育进行调控。果蝇 miRNAlet-7 在果蝇变态前就开始复制，一直贯穿整个成虫期，其表达与成虫的组织分化也具有相关性( Sempere et al.，2002) 。

　　此外 miR-100、miR-34、miR-125 都被猜测与果蝇的变态发育有着密切关系，但作用机理还不是很明确，尚需进一步的深入研究( Sempere et al.，2002; Liu et al.，2012) 。

　　3. 5 其他功能
　　果蝇 miR-124 对雄性性分化和性行为具有重要的调控作用。在果蝇群体中，miR-124 作用产生异常的激素导致miR-124 缺失突变体的雄性果蝇减少与雌性果蝇的交配率甚至出现了雄-雄求偶的现象。与此同时，雌性果蝇在与野生型雄果蝇交配的表现出的渴望远远超过与 miR-124 缺失突变体的交配( Weng et al.，2013) 。尽管 miR-124 突变体表现出更少的交配，但当只有 miR-124 突变体存在时可以成功的交配，说明了在自然竞争坏境中其处于劣势。此外，miR-279 参与了二氧化碳受体的形成，二氧化碳受体位置的不同可激发不同的嗅觉行为。二氧化碳受体一般位于果蝇的上触角，但miR-279 的缺失会使果蝇二氧化碳感受组织位于下颚须，这种结果提供了多样性的受体( Hartl et al.，2011) 。miRNA 还能调控果蝇能量动态平衡和昼夜节律，Teleman 等( 2006) 还发现了果蝇 miR-278 在能量动态平衡中起作用。从果蝇头部细胞中鉴定出调控昼夜节律的 miRNA bantam 的靶基因为clock，在家蚕中也被证实( Liu et al.，2009) 。已有研究表明果蝇 miR-277 可通过调节与缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸等相关酶的活性，来调节缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的代谢( Essling-er et al.，2013) 。此外，miRNA 被证实在表观遗传中也发挥作用，但作用机制还需进一步研究。

　　4 果蝇 miRNA 在人类疾病研究中的作用

　　miRNA 在生物体内发挥着广泛而重要的作用，尤其是与代谢、神经性疾病以及肿瘤的发生密切相关。在果蝇中，miR-308 可通过负反馈调节 dMyc 基因的正常表达以保证果蝇的正常发育，Myc 基因为一组癌基因，Myc 蛋白在体内必须受到严格的控制，其含量过多或者过少都会引起生物生长发育异常，研究发现在果蝇体内，miR-308 可与 dMyc 蛋白结合致使 miR-308 的过表达，而 miR-308 的过表达会干扰 dMyc 基因 mRNA 的翻译导致 dMyc 蛋白含量的减少。所以，在果蝇体内 dMyc 蛋白本身的存在反馈调节 Myc 蛋白的含量。无论miR-308 的过表达还是 dMyc 含量过高都会使果蝇致死，若二者结合能力提高，能够恢复 miR-308 与 dMyc 蛋白水平之间的平衡来抑制细胞凋亡( Daneshvar et al.，2013) ，这一研究结果揭示了这个敏感的反馈调节的重要性，可以预防异常 dMyc蛋白引起的疾病，例如人体癌症的发生。

　　最近果蝇 miR-34 也被证实与果蝇寿命和神经退化相关联，Liu 等( 2012) 利用 Northern blot 技术检测不同年龄段中miR-34 的表达，发现 miR-34 在果蝇发育期几乎检测不到，但在成熟期却有很高表达，而后被证实 miR-34 表达上调，可使果蝇寿命延长，缓和神经元退化，反之缺失 miR-34 加速脑老化( Liu et al.，2012; Soni et al.，2013) 。与果蝇 miR-34 同源的小鼠 miR-34c 被证实其异常会引发海马体老年痴呆( Zo-voilis et al.，2011) 。而衰老是神经退行性疾病发生和发展的重要因素之一，果蝇 miR-34 可抑制衰老这一研究成果对研究人类这一类疾病的研究带来了曙光。此外，miR-14 参与调控果蝇的新陈代谢以及胰岛素的生成，通过过表达、GFP 等的实验方法推测出 miR-14 靶标基因为与糖代谢紧密关联的Sugarbabe。miR-14 的作用机制还未被发现，但 miR-14 的缺失会导致果蝇的代谢缺陷( Varghese et al.，2010) 。Teleman等( 2006) 发现 miR-278 表现出控制脂肪储存和代谢的类胰岛素羧氨酸的过量表达的特点，说明果蝇 miR-278 对胰岛素的分泌有调控作用，这可能为糖尿病的新药研究带来新的契机。已有证据显示 miRNA 与多种癌症的发生有关，推测与miRNA 所调控的多种蛋白编码基因有关。

　　5 结语

　　随着计算机技术在 miRNA 研究领域的广泛应用，越来越多的 miRNA 分子将被鉴定出来。研究者们正在积极地寻找其靶分子，揭示其生物功能。虽然已确定了部分 miRNA 的某些功能，但大部分 miRNA 的功能尚不明确，miRNA 的作用机制也尚未完全弄清楚，有待进一步研究发现。有研究证实miRNA 可通过调控组蛋白的修饰引起染色体重塑以及调控DNA 甲基化酶的表达。在果蝇的研究领域，随着基因组测序工作的完成，可结合生物信息学对 miRNA 作用靶标及调控机制进行深入研究，以及对其他物种 miRNA 的不断研究都可以为遗传学提供新的研究方向与思路。miRNA 在果蝇胚胎发育、表观遗传学中的功能研究，将对人类一些疑难疾病，尤其是肿瘤和癌症的诊断具有重大意义。miRNA 在生命活动中具有广泛的调节功能，这有助于阐明药物的反应机制，也为药物设计与针对性治疗提供了重要依据。