探讨厦门类孟买血型表型产生的分子遗传学基础

   类孟买血型是一种较为罕见的红细胞血型，血型血清学主要表现为： 红细胞 H 抗原部分缺失，血清中存在抗 H 抗体，常导致 ABO 血型鉴定的错误。
   
    该血型表型患者如接受含 H 抗原的血液可引起严重的溶血性输血反应，严重影响安全输血。因此，类孟买血型的鉴定在临床输血中具有重要的临床意义。与 H 抗原形成有关的编码基因 FUT1 位于19q13. 3。FUT1 基因突变导致了 H 抗原合成障碍，产生类孟买血型表型。国内外基础研究对 H 抗原缺失的分子遗传学基础已有较为深入的研究，结果显示： H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异［1 －4］。因此，我们对本地区3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了FUT1 基因的克隆和测序，探讨本地区类孟买血型表型产生的分子遗传学基础。
   
    一、材料和方法
   
    1.研究对象
   
    收集我院 3 例经血型血清学鉴定为类孟买血型表型的患者标本，其中男性 2 例，女性 1 例； 年龄分别为：
   
    18 岁（ 个体 1） 、37 岁（ 个体 2） 、65 岁（ 个体 3） 。以正常 O 表型患者标本为正常对照血清学检测试剂和方法正定型用单克隆抗 A、抗 B 、抗 H 试剂及反定型用试剂 A、B、O 细胞，均购自上海市血液生物医药有限公司产品。用常规方法进行 ABO 及 H 血型鉴定，同时进行凝集抑制试验以检测唾液中血型物质。
   
   2. 样本 DNA 提取

    以全血 DNA 小量提取试剂盒 （ 美国 Omega 公司产品） 抽提 3 例类孟买血型患者及正常表型患者基因组 DNA，严格按照试剂说明书进行操作。
   
    3.FUT1 DNA 扩增

    PCＲ 引物参考文献［5］由上海生工生物工程公司合成。引物序列： F: 5'-CATTTGCTAATTCGCCTTTC-CTC-3‘，Ｒ： 5'-CCTTCTCTCCAACTCTCCCAAC-3’，扩增片段长度： 1286 bp。扩增反应体系体积 50 μl，其中： 2 × 缓冲液 25 μl，样本 DNA 2 μl，LA Taq 0. 5 μl（ 日本 TaKaＲa 公司产品） ，dNTP mix 1 μl，引物 F、Ｒ各 1 μl，灭菌双蒸水 19. 5 μl。PCＲ 参数： 94℃预变性5 min; 然后94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 2 min，30 个循环，72℃延伸 5 min 后冷却至 4℃。 PCＲ 扩增产物在 2% 低熔点琼脂糖凝胶上 100 V 电泳 30 min，凝胶成像仪成像，提示扩增成功后，从凝胶上切取目的 DNA 片段，用 AXYGEN 凝胶纯化试剂盒（ AXYGEN 公司产品） 纯化回收 DNA 片段。
   
   4. FUT1 基因测序

    纯化的 PCＲ 产物在 T4 DNA 连接酶作用下与 T 载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取 4 个阳性克隆，提取质粒，以质粒 DNA 为范本测序鉴定 FUT1基因突变。
   
    二、结 果
   
    1.红细胞 ABO、H 血型鉴定

    3 个研究个体在 ABO 常规血型鉴定中正定型均为：O 型，反定型也均为 O 型，但是 O 细胞均出现不同程度的凝集，同时自身对照均为阴性。进一步的血清学鉴定发现 3 个研究个体血清中均有抗 H 抗体，而红细胞上 H 抗原缺失（ 表 1） 。

   
    2.唾液中 ABH 血型物质测定

    凝集抑制试验证实 3 个研究个体均为分泌型，其中个体 1，2 唾液中均含有 A、H 物质，而个体 3 唾液中含有 B、H 物质（ 表 1） 。
   
    3.PCＲ 产物琼脂糖凝胶电泳分析

    高保真 DNA 聚合酶扩增目的。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像，可见单一的特异性条带，提示成功扩增 FUT1 基因编码区全长。
   
    4.FUT1 基因测序分析

    高保真 PCＲ 扩增产物，经 TA 克隆、测序及序列比对分析发现，个体 1 的 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1（ 547-552delAG） ，另 1 条染色体上为 h4（ 35C ＞ T） ，即 FUT1 基因型为 h1h4; 个体 2，3 的 2 条染色体上FUT1 基因均为 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型为 h1h1。
 

   
    讨 论

    类孟买血型是一种罕见的红细胞血型表型，其主要特征是红细胞表面 H 抗原部分或完全缺失，而分泌液中存在 H 物质。H 抗原是 Hh 血型系统的唯一抗原，是 A、B 血型抗原形成的基础。在正常情况下，FUT1 基因编码的 α1，2 岩藻糖基转移酶催化 L-岩藻糖连接到前体糖链上从而形成 H 抗原。因此，FUT1 基因的异常是形成类孟买血型的重要分子基础。FUT1 基因位于 19q13. 3，全长 5380 bp，其中编码序列长为 1095 bp，编码 365 个氨基酸。目前已经发现的 FUT1 基因异常包括缺失、错义突变和插入突变等，包含了 30 种不同的突变。众多国内外研究已表明： H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异。目前，本地区已经报道的 FUT1 基 因 突 变 分 子 基 础 仅 有 h1 （ 547-552delAG） 、h2 （ 880-882delTT） 、h3 （ 658 C ＞ T） 、h9（ 424 C ＞ T）［1 －6］。为了进一步揭示对本地区类孟买血型个体的 FUT1 基因突变类型，我们对 3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了 FUT1 基因的克隆和测序及比对分析。
   
    我们首先通过常规血型鉴定、抗体筛选等血清学及唾液血型物质检测等方法，确定了 3 例类孟买血型个体。随后，我们提取了 3 个个体的基因组DNA。通过高保真 PCＲ 扩增了 FUT1 DNA，经过 TA克隆及测序证实了 3 例类孟买血型个体中，个体 1的 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1（ 547-552delAG） ，另 1 条染色体上为 h4（ 35C ＞ T） ，即 FUT1 基因型为h1h4; 个体 2，3 的 2 条染色体上 FUT1 基因均为 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型为 h1h1。本研究的结果进一步证实了池泉等［6］报道的本地区类孟买血型个体的主要流行基因（ h1 和 h2） 的结论。同时，我们也发现 h4 基因型同样存在于本地区类孟买血型个体中。
   
    关于 h4 基因型在类孟买血型形成中的作用，目前研究还存在争议。许先国等［7］研究结果认为，h4基因型（ 35C ＞ T） 是一种基因多态性，而不是引起类孟买型的基因突变，但是不能完全解释郭忠慧等［8］研究发现的 2 例 h4h4 纯合子的类孟买血型个体。
   
    我们研究的个体 3 FUT1 基因为 h1/h4，由于 FUT1基因的遗传方式是常染色体隐性遗传，因此我们认为，h4 基因型的存在导致类孟买个体3 另1 条染色体上 FUT1 无效表达，最终导致了个体 3 类孟买血型表型的形成。
   
    总之，类孟买血型的分子基础在不同人群存在着差异，并且尚有存在争议的问题。因此，扩大样本量，进一步挖掘类孟买血型个体的 FUT1 基因突变情况，将有利于我们理解类孟买血型表型形成的机制。
   
    参 考 文 献：
   
    1 Daniels G. Human blood groups. Oxford: Blackwell Science Ltd，2002: 185 － 187.
   
    2 李勇，马学严。 实用血液免疫学。 北京： 科学出版社。 2006: 146 －155.
   
    3 Cai XH，Jin S，Liu X，et al. Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene. Blood Transfus，2011; 9（ 4） : 466 － 468.
   
    4 Storry JＲ，Johannesson JS，Poole J，et al. Identification of six newalleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individualswith Bombay and Para-Bombay phenotypes. Transfusion，2006; 46（ 12） : 2149 －2155.
   
    5 黄豪博，范丽萍，魏世金，等。 中国福建地区类孟买血型个体FUT1 基因突变研究。 中国实验血液学杂志，2010; 18 （ 5） : 1338－ 1340.
   
    6 池泉，张爱，任本春，等。 类孟买血型基因分析及 1 种 FUT1 新无效等位基因的发现。 中国输血杂志，2012; 25（ 11） : 1152 －1155.
   
    7 许先国，洪小珍，吴俊杰，等。 中国人群中 ɑ1，2 岩藻糖基转移酶基因 C35T 变异的频率研究。 中华医学遗传学杂志，2005; 22（ 6） : 657 －660.
   
    8 郭忠慧，向东，朱自严，等。 中国类孟买型 FUT1 和 FUT2 基因研究。 中华医学遗传学杂志，2004; 21（ 5） : 417 －421.