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探讨厦门类孟买血型表型产生的分子遗传学基础

来源:学术堂 作者:刘老师
发布于:2014-06-11 共2956字

论文摘要
   类孟买血型是一种较为罕见的红细胞血型,血型血清学主要表现为: 红细胞 H 抗原部分缺失,血清中存在抗 H 抗体,常导致 ABO 血型鉴定的错误。
   
    该血型表型患者如接受含 H 抗原的血液可引起严重的溶血性输血反应,严重影响安全输血。因此,类孟买血型的鉴定在临床输血中具有重要的临床意义。与 H 抗原形成有关的编码基因 FUT1 位于19q13. 3。FUT1 基因突变导致了 H 抗原合成障碍,产生类孟买血型表型。国内外基础研究对 H 抗原缺失的分子遗传学基础已有较为深入的研究,结果显示: H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异[1 -4]。因此,我们对本地区3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了FUT1 基因的克隆和测序,探讨本地区类孟买血型表型产生的分子遗传学基础。
   
    一、材料和方法
   
    1.研究对象
   
    收集我院 3 例经血型血清学鉴定为类孟买血型表型的患者标本,其中男性 2 例,女性 1 例; 年龄分别为:
   
    18 岁( 个体 1) 、37 岁( 个体 2) 、65 岁( 个体 3) 。以正常 O 表型患者标本为正常对照血清学检测试剂和方法正定型用单克隆抗 A、抗 B 、抗 H 试剂及反定型用试剂 A、B、O 细胞,均购自上海市血液生物医药有限公司产品。用常规方法进行 ABO 及 H 血型鉴定,同时进行凝集抑制试验以检测唾液中血型物质。
   
   2. 样本 DNA 提取

    以全血 DNA 小量提取试剂盒 ( 美国 Omega 公司产品) 抽提 3 例类孟买血型患者及正常表型患者基因组 DNA,严格按照试剂说明书进行操作。
   
    3.FUT1 DNA 扩增

    PCR 引物参考文献[5]由上海生工生物工程公司合成。引物序列: F: 5'-CATTTGCTAATTCGCCTTTC-CTC-3‘,R: 5'-CCTTCTCTCCAACTCTCCCAAC-3’,扩增片段长度: 1286 bp。扩增反应体系体积 50 μl,其中: 2 × 缓冲液 25 μl,样本 DNA 2 μl,LA Taq 0. 5 μl( 日本 TaKaRa 公司产品) ,dNTP mix 1 μl,引物 F、R各 1 μl,灭菌双蒸水 19. 5 μl。PCR 参数: 94℃预变性5 min; 然后94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸 2 min,30 个循环,72℃延伸 5 min 后冷却至 4℃。 PCR 扩增产物在 2% 低熔点琼脂糖凝胶上 100 V 电泳 30 min,凝胶成像仪成像,提示扩增成功后,从凝胶上切取目的 DNA 片段,用 AXYGEN 凝胶纯化试剂盒( AXYGEN 公司产品) 纯化回收 DNA 片段。
   
   4. FUT1 基因测序

    纯化的 PCR 产物在 T4 DNA 连接酶作用下与 T 载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取 4 个阳性克隆,提取质粒,以质粒 DNA 为范本测序鉴定 FUT1基因突变。
   
    二、结 果
   
    1.红细胞 ABO、H 血型鉴定

    3 个研究个体在 ABO 常规血型鉴定中正定型均为:O 型,反定型也均为 O 型,但是 O 细胞均出现不同程度的凝集,同时自身对照均为阴性。进一步的血清学鉴定发现 3 个研究个体血清中均有抗 H 抗体,而红细胞上 H 抗原缺失( 表 1) 。

论文摘要
   
    2.唾液中 ABH 血型物质测定

    凝集抑制试验证实 3 个研究个体均为分泌型,其中个体 1,2 唾液中均含有 A、H 物质,而个体 3 唾液中含有 B、H 物质( 表 1) 。
   
    3.PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分析

    高保真 DNA 聚合酶扩增目的。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像,可见单一的特异性条带,提示成功扩增 FUT1 基因编码区全长。
   
    4.FUT1 基因测序分析

    高保真 PCR 扩增产物,经 TA 克隆、测序及序列比对分析发现,个体 1 的 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1( 547-552delAG) ,另 1 条染色体上为 h4( 35C > T) ,即 FUT1 基因型为 h1h4; 个体 2,3 的 2 条染色体上FUT1 基因均为 h1( 547-552delAG) ,即 FUT1 基因型为 h1h1。
 

论文摘要

论文摘要

   
    讨 论

    类孟买血型是一种罕见的红细胞血型表型,其主要特征是红细胞表面 H 抗原部分或完全缺失,而分泌液中存在 H 物质。H 抗原是 Hh 血型系统的唯一抗原,是 A、B 血型抗原形成的基础。在正常情况下,FUT1 基因编码的 α1,2 岩藻糖基转移酶催化 L-岩藻糖连接到前体糖链上从而形成 H 抗原。因此,FUT1 基因的异常是形成类孟买血型的重要分子基础。FUT1 基因位于 19q13. 3,全长 5380 bp,其中编码序列长为 1095 bp,编码 365 个氨基酸。目前已经发现的 FUT1 基因异常包括缺失、错义突变和插入突变等,包含了 30 种不同的突变。众多国内外研究已表明: H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异。目前,本地区已经报道的 FUT1 基 因 突 变 分 子 基 础 仅 有 h1 ( 547-552delAG) 、h2 ( 880-882delTT) 、h3 ( 658 C > T) 、h9( 424 C > T)[1 -6]。为了进一步揭示对本地区类孟买血型个体的 FUT1 基因突变类型,我们对 3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了 FUT1 基因的克隆和测序及比对分析。
   
    我们首先通过常规血型鉴定、抗体筛选等血清学及唾液血型物质检测等方法,确定了 3 例类孟买血型个体。随后,我们提取了 3 个个体的基因组DNA。通过高保真 PCR 扩增了 FUT1 DNA,经过 TA克隆及测序证实了 3 例类孟买血型个体中,个体 1的 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1( 547-552delAG) ,另 1 条染色体上为 h4( 35C > T) ,即 FUT1 基因型为h1h4; 个体 2,3 的 2 条染色体上 FUT1 基因均为 h1( 547-552delAG) ,即 FUT1 基因型为 h1h1。本研究的结果进一步证实了池泉等[6]报道的本地区类孟买血型个体的主要流行基因( h1 和 h2) 的结论。同时,我们也发现 h4 基因型同样存在于本地区类孟买血型个体中。
   
    关于 h4 基因型在类孟买血型形成中的作用,目前研究还存在争议。许先国等[7]研究结果认为,h4基因型( 35C > T) 是一种基因多态性,而不是引起类孟买型的基因突变,但是不能完全解释郭忠慧等[8]研究发现的 2 例 h4h4 纯合子的类孟买血型个体。
   
    我们研究的个体 3 FUT1 基因为 h1/h4,由于 FUT1基因的遗传方式是常染色体隐性遗传,因此我们认为,h4 基因型的存在导致类孟买个体3 另1 条染色体上 FUT1 无效表达,最终导致了个体 3 类孟买血型表型的形成。
   
    总之,类孟买血型的分子基础在不同人群存在着差异,并且尚有存在争议的问题。因此,扩大样本量,进一步挖掘类孟买血型个体的 FUT1 基因突变情况,将有利于我们理解类孟买血型表型形成的机制。
   
    参 考 文 献:
   
    1 Daniels G. Human blood groups. Oxford: Blackwell Science Ltd,2002: 185 - 187.
   
    2 李勇,马学严。 实用血液免疫学。 北京: 科学出版社。 2006: 146 -155.
   
    3 Cai XH,Jin S,Liu X,et al. Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene. Blood Transfus,2011; 9( 4) : 466 - 468.
   
    4 Storry JR,Johannesson JS,Poole J,et al. Identification of six newalleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individualswith Bombay and Para-Bombay phenotypes. Transfusion,2006; 46( 12) : 2149 -2155.
   
    5 黄豪博,范丽萍,魏世金,等。 中国福建地区类孟买血型个体FUT1 基因突变研究。 中国实验血液学杂志,2010; 18 ( 5) : 1338- 1340.
   
    6 池泉,张爱,任本春,等。 类孟买血型基因分析及 1 种 FUT1 新无效等位基因的发现。 中国输血杂志,2012; 25( 11) : 1152 -1155.
   
    7 许先国,洪小珍,吴俊杰,等。 中国人群中 ɑ1,2 岩藻糖基转移酶基因 C35T 变异的频率研究。 中华医学遗传学杂志,2005; 22( 6) : 657 -660.
   
    8 郭忠慧,向东,朱自严,等。 中国类孟买型 FUT1 和 FUT2 基因研究。 中华医学遗传学杂志,2004; 21( 5) : 417 -421.

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