p53基因Arg72Pro多样性与青海胃癌遗传易感性的关系

　　p53 基因第 72 密码子多态性与胃癌存在易感性。有报道认为，其易感性存在区域性［1 －3］。青海地区地处青藏高原，平均海拔 3 500 m，是胃癌高发区，胃癌检出率高达 10． 7%，高于其他地区［4］。本研究旨在通过对该地区胃癌基因型的分析，探讨p53 基因 Arg72Pro 多态性与青海地区胃癌遗传易感性的关系及胃癌发生部位的关系。

　 　1 材料与方法

    1． 1 研究对象

    胃癌组64 例，为2012 年12 月 ～2013 年9 月在青海大学附属医院行胃镜检查并经病理确诊的汉族胃癌患者，按胃癌发生部位分为贲门部、胃底部、胃体部、胃窦部四组; 其中男 51 例，女 13 例，年龄( 42～ 85) 岁，平均 61． 28 岁。对照组 72 例，为同期同医院排除肿瘤和消化系统疾病的汉族健康体检者，其中男 56 例，女 16 例，年龄( 40 ～ 83) 岁，平均 58． 82岁。两组研究对象均在青海地区居住 20 年以上。

　　两组间性别和年龄分布经 χ2检验差异无统计学意义( P 分别为 0． 79、0． 90) 。

　　1． 2 方法

    1． 2． 1 外周血基因组 DNA 的提取

    真空采集管抽取胃癌组及对照组个体静脉血5 mL，以 EDTA 抗凝，转移 2 mL 至 EP 管，置 － 80 ℃冰箱保存，使用柱式血液基因组提取试剂盒( 生工生物工程上海股份有限公司) 从外周血白细胞中提取基因组 DNA，提取的基因组 DNA 用紫外分光光度计( Eppendorf Bio Photometer) 测定含量并调整浓度后置 －20 ℃冰箱保存。

　　1． 2． 2 引物及探针的设计与合成

    根据参考文献［1］及 Primer 5． 0 软件设计荧光标记探针及引物。

    探针及引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

　　1． 2． 3 PCＲ 扩增反应体系和基因分型检测

    PCＲ 扩增反应体系见表 1。

　　将加好样品的 384 孔板放在 LightCycler480Software Setup( Ｒoche 罗氏) 荧光定量 PCＲ 仪进行反应。反应条件: 50 ℃ 预变性 2 min，95 ℃ 变性10 min，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，循环 40 次，再 72 ℃延伸 6 min。

　　根据探针设计，自 FAM 通道检测到的荧光信号为 Arg/Arg 基因型，自 VIC 通道检测到的荧光信号为 Pro/Pro 基因型，两通道同时检测到的荧光信号为 Arg/Pro 基因型。三种基因型荧光信号特点如图1。

　　1． 3 统计学处理方法

    用 SPSS17． 0 软件完成，用 χ2检验确认基因是否符合 Hardy － Weinberg 遗传平衡，并用 χ2检验进行各基因型和等位基因频率分布差异的比较及基因型频率在胃癌不同部位的分布差异的比较。所有统计检验均为双侧检验，检验水准 α =0． 05。

　　2 结果

    2． 1 p53 基因多态性在两组中的分布情况

    经检验两组基因型分布均符合 Hardy － Wein-berg 平衡规律( P ＞ 0． 05) 。等位基因 Arg 和等位基因 Pro 在 胃 癌 中 的 频 率 分 布 分 别 为 48． 44%、51． 56% ，在对照组中分别为 42． 36% 、57． 64% 。两组等位基因频率分布无统计学差异( P = 0． 32) 。

　　Arg / Arg、Pro / Pro、Arg / Pro 三种基因型在胃癌组中的频率分别为 21． 86%、25． 00%、53． 14%，在对照组中分别为 16． 67%、31． 94%、51． 39%，三种基因型分布在两组中无显著性差异( P =0． 59) ，见图 1、表2．

    2.2 p53 基因型与胃癌部位的关系

    本研究显示，胃癌病例中以胃体部胃癌最常见( 占 54． 70%) ，胃 底 部 胃 癌 所 占 比 例 最 小 ( 占6． 25% ) 。Arg / Arg 基因型频率在贲门部、胃底部、胃体部、胃窦部分别为 7． 14%、7． 14%、57． 14%、28． 57% ; Pro / Pro 基 因 型 频 率 依 次 为 12． 50% 、6． 25% 、62． 5% 、18． 75% ; Arg / Pro 基因型频率依次为 26． 47%、5． 88%、50． 00%、17． 65%。经 χ2检验，三种不同基因型频率在不同部位胃癌的分布无统计学差异( χ2= 5． 16，P = 0． 74) ，见表 3。

　　3 讨论

    胃癌的发生、发展是多基因、多步骤的复杂过程。近几年来，胃癌的分子遗传学和分子病理学方面的研究取得了突破性进展，人们认识到胃癌发生的根本原因可能是细胞内部基因结构及其表达的异常改变，涉及到多种癌基因、抑癌基因、凋亡调节基因和 DNA 修复调节基因等的异常和积累，是一个长期的分阶段的多基因突变累积的过程。环境和遗传的致癌因素引起细胞遗传物质改变的主要靶基因是原癌基因和抑癌基因，原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活［5］均可导致细胞的恶性转化。近年来研究胃癌的抑癌基因较多，有研究表明在抑癌基因中，p53 基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，也是胃癌中最常突变的抑癌基因［6］。

　　有关研究发现，p53 基因具有多态性，其第 72位密码子的 Arg/Pro 是一个常见的多态位点，多态基因可编码或含精氨酸( Arg) 或含脯氨酸( Pro) 的两种 p53 蛋白，使得一般人群中携带 Arg/Arg、Pro / Pro和 Arg / Pro［7］三种基因型之一，这种多态性在一般人群中普遍存在。p53 基因第 72 位密码子Arg / Pro 多态与多种恶性肿瘤的遗传易感性有关，目前研究较多的是肺癌、宫颈癌、食管癌等，但与胃癌的遗传易感性研究较少，且因研究对象的不同而得出了不同的结论。Kui － Jie Liu 等［8］进行 Meta 分析后得出在亚洲人群中，Arg/Arg 基因型可降低胃癌的发病风险，且基因型的表达与胃癌的发生阶段、发生部位、分化程度及转移情况均有关系。Filho 等［9］报道 Arg/Arg 基因型是胃癌发生的一个保护性因素，携带 Arg/Arg 基因型者胃癌发生年龄相对较晚，而携带 Pro/Pro 基因型者胃癌发生年龄较早。Shep-herd 等［10］报道，Arg 基因型白种人易患贲门癌，Pro基因型黑种人易患胃窦癌。本研究显示 p53 基因第72 密码子多态性与胃癌部位无相关性。Shen 等［11］认为中国人群中 p53Arg 等位基因与非贲门胃癌相关，且饮酒能显著提高 Arg 等位基因个体患胃癌的风险。张伟华等［12］报道 p53 基因第 72 密码子Arg / Arg基因型与西北地区人群胃癌，尤其是弥漫性胃癌的高风险具有相关性，同时显示，西北地区胃癌发生的年龄较早，50 岁以下的发病者占发病总数的33． 12% ; 本研究显示 50 岁以下的发病者占发病总数的 14． 56%，与该报道差异较大，可能与地区差异有关。而单勇等［13］报道 Pro/Pro 基因型与甘肃河西地区胃癌危险度有关，Pro 基因型携带者的胃癌发病风险是 Arg/Arg 基因型携带者的 1． 846 倍，Pro 基因型可能是甘肃河西地区汉族人群胃癌重要的遗传易感因素，并且发现该地区贲门胃底癌比例较高，占胃癌组的 41． 4%，携带 Pro/Pro 基因型者患贲门胃底癌及弥漫型胃癌风险明显增高，考虑 Pro/Pro 基因型在引起 p53 抑癌功能变化、诱导细胞凋亡能力降低、细胞恶性生长方面起作用，使患胃癌危险性升高。本研究显示 p53 基因 第 72 密码子多态性与胃癌发生易感性无显著相关性。这与 Mojtahedi 等［14］报道的 p53 基因 Arg72Pro 多态性与印度患者的胃癌无相关性相一致，该报道中，Arg 等位基因频率在胃癌及对照组中的频率分别为 59． 7%、59． 2%，Pro等位基因频率在胃癌及对照组中的频率分别为40． 3% 、40． 8% ; 本研究中 Arg 等位基因频率在胃癌及对照组中的频率分别为 48． 44%、42． 36%，Pro 等位基因频率在胃癌及对照组中的频率分别为51． 56% 、57． 64% 。

　　研究青海地区 p53 基因第 72 密码子多态性与胃癌易感性具有重要的地域性意义。大部分研究显示 p53 基因第 72 密码子多态性与胃癌易感性有关。

　　而我们的研究显示 p53 基因第 72 密码子多态性与青海地区胃癌易感性无明显相关，且与胃癌发生部位也无明显相关性。另外，目前关于不同民族胃癌发生易感性与 p53 基因第 72 密码子多态性的关系报道非常有限，而青海地处高原，是一个多民族省份，藏、回、土、撒拉和蒙古等五个少数民族人口占全省人口近一半。故进一步研究可在加大样本量、不同民族、胃癌发生相关因素等方面进行。本研究为初步研究，最终结论需进一步扩大样本验证。