植物学论文
赤潮已成为世界范围内的主要海洋生态问题之一，对海洋生态环境、人类健康和社会经济带来巨大威胁[1-4].甲藻是引发赤潮的主要物种。但是甲藻，尤其是微型甲藻的形态特征非常近似，且在不同的生活史阶段，其个体大小及形态也会发生改变，因此，甲藻的种类鉴定非常困难。如塔玛亚历山大藻（ Alexandrium tarmarense） 、链状亚历山大藻（ A. catenella） 和芬迪湾亚历山大藻（ A. fundy-ense） 因其形态非常相似，个别甲片的结构难以区分，形态分类有一定的难度和不确定性，为方便起见统称为塔玛亚历山大藻复合体（ A. tamarensespecies complex）[5].
光学显微镜和扫描电镜是甲藻形态鉴定的常规手段，但需要花费大量时间和精力，且鉴定人员需具备大量实践经验。PCR 方法可以快速分析甲藻的遗传特征，是疑难甲藻种类鉴定的重要辅助手段。然而 PCR 方法的缺陷是需要大量基因组 DNA 作为模板，需要对甲藻细胞进行分离纯化获取大量单克隆细胞，而这一过程即费时费力，又不能确保分离纯化培养的成功，限制了 PCR 方法在甲藻鉴定中的应用。单细胞 PCR 技术是在细胞水 平 上 进 行 DNA 或 RNA 分 析 的 PCR 方法[6-16],能够克服海洋甲藻分离纯化培养的瓶颈，直接分析环境甲藻单细胞的遗传特征。但是，低拷贝的目标基因导致其扩增效率和重复性较低，且不适宜多位点、多基因遗传分析。单细胞全基因组扩增是遗传学研究的一项重要技术[17],是一种从有限量 DNA 获得充足量 DNA 的技术。通过单细胞全基因组扩增，可以从微量基因组 DNA 获得大量基因组 DNA,从而满足后续遗传分析。单细胞 PCR 技术与单细胞全基因组扩增技术有机结合，可直接分析海洋环境中甲藻细胞的遗传特征从而进行分子鉴定，甚至进行系统进化及种群遗传分析。
固定方式对甲藻的分类鉴定至关重要。戊二醛、鲁格氏液和福尔马林是海洋浮游植物调查中常用的细胞固定试剂[18].戊二醛固定细胞的形状、颜色及一些微细结构的保存完好，适用于甲藻扫描电镜分析。鲁哥氏液对甲藻鞭毛固定效果较好，常用于甲藻的光学形态分析。但碘会使细胞染色，而细胞颜色是甲藻的主要分类特征。福尔马林也是海洋浮游植物调查常用的固定试剂。
本研究的目的是结合形态学特征分析，建立海洋甲藻单细胞 PCR 鉴定技术，为环境甲藻的快速、准确鉴定提供技术支持。因此，需要①确立环境甲藻的固定方法，即能保持其原有形态特征，进行传统的形态学鉴定，又能最大限度保持其基因组 DNA 不受到破坏，进行辅助的分子生物学鉴定； ②将全基因组扩增技术和单细胞 PCR 技术有机结合，提高单细胞 PCR 技术的成功率和可重复性。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
试验用塔玛亚历山大藻藻种由国家海洋环境监测中心海洋藻类种质库提供。在不加硅酸盐的f /2 培养基中培养塔玛亚历山大藻。
1. 2 塔玛亚历山大藻细胞的固定
分别用 2% 戊二醛、鲁哥氏液和福尔马林固定塔玛亚历山大藻细胞，并于室温下遮光保存。固定液的配制方法详见海洋调查规范[18].
1. 3 塔玛亚历山大藻单细胞全基因组扩增： 多重替代 扩 增 （ Multiple displacement amplification,MDA）
在光学显微镜下，用毛细管分别吸取固定保存 10 d、20 d 和 30 d 单个塔玛亚历山大藻细胞，每个处理平行吸取 3 个细胞。鲁哥氏液固定的细胞需先移至 1 μmol/L 的硫代硫酸钠溶液中进行脱色，然后转移至无菌的超纯水中清洗，最后转移至薄壁管中备用。福尔马林和 2% 戊二醛固定的细胞经无菌的超纯水清洗后直接移至薄壁管中备用。
采用 phi 29 DNA 聚合酶和随机六聚体引物（ NEB（ 北京） 有限公司） 对塔玛亚历山大藻单细胞进行全基因组扩增。首先将样品加热进行DNA 变性及引物退火反应，在含有塔玛亚历山大藻单细胞的薄壁管中加入： 5. 7 μL 的双蒸水（ ddH2O） ,1 μL 的 10 × phi29DNA 聚合酶反应缓冲液，2. 5 μL 的六聚体随机引物（ 100 μmol/L） ,95℃ 变性 3 min 后立即置于冰上冷却 15 min; 离心收集管壁上的液体后加入 0. 5 μL 的 dNTPs（ 10μmol/L） ,0. 2 μL 的 100 × BSA,0. 5 μL 的 phi29DNA 聚合酶（ 10 U / μL） ,最终反应体系为 10 μL,30℃ 恒温过夜进行单细胞全基因组扩增，扩增产物稀释数十倍后备用。
1. 4 单细胞全基因组扩增效果的 PCR 检测
采用 PCR 扩增方法检测塔玛亚历山大藻单细胞全基因组扩增的效果。PCR 扩增体系为 25μL,包括： 2. 5 μL 的 10 × Ex Tap buffer,1. 5 μL 的MgCl2（ 25 μmol/L） ,0. 5 μL 的 dNTPs （ 10 μmol/L） ,0. 5 μL 的正、反向扩增引物 （ 10 μmol / L） ,0. 1 μL 的 Taq DNA 聚合酶（ 5 U / μL） ,和 1 μL 单细胞全基因组扩增产物，最后加无菌 ddH2O 至终体积 25 μL.PCR 扩增引物序列分别是 ATF11（ F: AGCAGCGCGGCGGGAGATT; R: ACCTGCG-GCTGCGACACGACT） 和 A09 （ F: CAGTGGCTA-AAAGCGATACC; R: CAGAGGCGAAGGATTGATG） .
采用降落 PCR（ Touch down PCR） 程序进行 PCR扩增，反应条件为： 94℃ 预变性 5 min; 94℃ 变性30 s,60℃ 退火 30 s,72℃ 延伸 1 min; 退火温度每个循环下降1℃，直至降到50℃； 然后接94℃变性30 s,50℃ 退火 30 s,72℃ 延伸 1 min,循环 25 次；最后 72℃延伸 7 min.PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，通过扩增条带的有无及亮暗判定单细胞全基因组扩增效果。
1. 5 海水环境中甲藻的单细胞 PCR 检测
采水器采集大连凌水湾海域（ 38°51'38. 82″N,121°32'46. 18″E） 海水样品，2% 戊二醛固定。毛细管挑取单个细胞，光学显微镜下拍摄形态图片后按 1. 3 方法进行单细胞全基因组扩增。扩增产物适当稀释后作为模板，PCR 扩增线粒体细胞色素氧化酶 I（ Cox 1） ,并进行测序分析（ 测序结果由上海生工生物股份有限公司完成） ,将 cox 1基因序列放入美国国立生物技术信息中心（ Na-tional Center of Biotechnology Information,NCBI） 基因数据库中进行 BLAST 比对分析。