植物学论文
2 结果与讨论
2. 1 塔玛亚历山大藻单细胞全基因组扩增
全基因组扩增是对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，该技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组 DNA 扩增而增加 DNA的总量，进而完成全基因组 DNA 组成的研究。采用 phi 29 DNA 聚合酶和随机六聚体引物对塔玛亚历山大藻单细胞进行全基因组扩增后，基因组DNA 含量明显增加，且 DNA 片段主要集中在1 kb~ 2 kb 之间（ 图 1） ,满足后续的遗传学分析所需的 DNA.
目前，单细胞 PCR 是赤潮生物分子鉴定的新手段，其以单个细胞的基因组 DNA 进行 PCR 反应扩增特定标记基因，直接分析环境样品中的赤潮生物的遗传特征，克服了赤潮生物单细胞分离纯化培养的瓶颈。但由于单个细胞所含的微量基因组 DNA,以及细胞内含物对 PCR 反应的抑制，导致 PCR 扩增效率和重复性低。单细胞全基因组扩增技术和单细胞 PCR 技术有机结合，不但能提高单细胞 PCR 的扩增效率和重复性，突破了单细胞 PCR 的局限性； 而且使单细胞甲藻的多位点、多基因遗传分析以及环境中甲藻的种群遗传学分析也成为可能。
2. 2 不同固定剂对单细胞 PCR 的影响
分别采用 2%戊二醛、鲁格氏液和福尔马林 3种固定试剂固定塔玛亚历山大藻细胞。在第 10d、20 d 和 30 d 时，微细管吸取单个细胞，phi 29DNA 聚合酶进行单细胞全基因组扩增。以单细胞全基因组扩增产物为模板，A09 和 ATF11 两对引物 PCR 扩增塔玛亚历山大藻特异基因片段，琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增结果（ 图 2） .电泳结果显示： 阴性对照中没有检测到 PCR 产物，而阳性样品都有 PCR 产物，说明 PCR 扩增体系正常。在 30 d 内，引物 A09 和 ATF11 扩增 2% 戊二醛固定单细胞均能产生特异性条带，且 3 个重复全部有特异性条带产生（ 成功率为 100%） ; 但随着固定时间的延长，引物 A09 的扩增效率在 30 d时有所降低，2 个细胞扩增出明亮条带（ 66. 7%） ,1 个细胞只扩增出淡淡条带（ 33. 3% ,图 2C: 泳道9） ; 而引物 ATF11 的扩增效率未出现明显变化。
鲁格氏液固定细胞的单细胞 PCR 扩增效果和 2%戊二醛固定细胞近似。在 30 d 内，引物 A09 和ATF11 扩增均能产生特异性条带，且成功率为100% ; 但随着固定时间的延长，引物 A09 和ATF11 的扩增效率在 30 d 时有所降低，66. 7% 的细胞扩增出明亮条带，33. 3% 的细胞只扩增出淡淡条带（ 图 2C: 泳道 9 和图 2F: 泳道 12） .福尔马林固定细胞不能进行单细胞 PCR 分析，引物 A09和 ATF11 均未扩增出任何特异性条带（ 泳道 13,14 和 15） .
研究结果表明： 1 个月内，2% 戊二醛和鲁格氏液固定的样品均能用于单细胞 PCR 分析。但由于鲁格氏液的碘会抑制 PCR 的扩增，影响单细胞 PCR 的扩增效率和重复性； 且碘会使细胞染色，而细胞颜色是甲藻的重要分类特征，建议采用2% 戊二醛固定海洋甲藻细胞，以便将传统形态分类和分子生物学分类手段有机结合，更快、更准确的进行甲藻鉴定。福尔马林固定样品不适宜海洋甲藻的单细胞 PCR 分析。
2. 3 环境样品中甲藻的遗传学分析
单细胞 PCR 技术与传统形态鉴定方法相结合，可快速、准确鉴定甲藻种类。采集大连凌水湾海域海水样品，2% 戊二醛固定。在光学显微镜下，毛细管挑取单个细胞，拍摄形态图片（ 图 3） .结果显示： 2%戊二醛固定锥形多甲藻细胞的上壳呈锥形，下壳末端明显叉分成两个底角； 横沟、纵沟、鞭毛和细胞核等分类特征清晰可见； 细胞保持原有的形态和细胞颜色等特征，适合形态学鉴定。
锥形多甲藻单细胞全基因组扩增后，PCR 扩增线粒体细胞色素氧化酶 1（ Cox 1） ,测序结果在NCBI 进行 BLAST 分析，结果显示最高相似度仅为 88%（ 图 4） ,因此仅仅依据细胞色素氧化酶 I序列不能准确确定其分类地位。但结合其形态学特征，我们可以鉴定为锥形多甲藻。以 Peridiniumcox1 为关键词在 NCBI 基因数据库查询，结果显示 只 有 1 条 Peridinium willei cox1 数 据（ AB232671） .可见，甲藻的分子诊断的成功与否依赖于相关分子数据库的覆盖程度。因此，在现阶段，将甲藻的遗传信息与形态学特征相结合，是环境甲藻分子诊断的一个有效途径。
3 结 论
（ 1） 甲藻单细胞经全基因组扩增后基因组DNA 含量增加，可满足甲藻单细胞的遗传学分析，也能满足海洋甲藻的种群遗传学分析。
（ 2） 1 个月内，2% 戊二醛和鲁格氏液固定的样品均能用于单细胞 PCR 分析。但考虑将传统形态分类和分子生物学分类手段有机结合，本文建议采用 2%戊二醛固定海洋甲藻细胞。福尔马林固定样品不适宜海洋甲藻的单细胞 PCR 分析。
（ 3） 形态学特征分析和单细胞 PCR 有机结合，是现阶段环境中疑难甲藻种类快速、准确鉴定的一个有效手段。（图略）
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