水浴加热后微囊藻的数量统计方法

　　0 前言

　　微囊藻属 Microcystis 隶属于蓝藻门 Cyanophyta、色球藻目 Oococcales、微囊藻科 Microcystaceae,群体微小或大型自由漂浮[1].微囊藻适应温度为 25℃ ~30℃，PH 为 8. 0 ~9. 5 的水域生长，在环境条件适合其生长时会大规模繁殖形成水华[2].水华微囊藻问题在国内日益严重，就磁湖而言，每年夏季都会爆发大规模微囊藻水华。微囊藻水华爆发不仅会对湖泊生态系统带来严重的危害[3],而且严重影响人们的生产生活。水华微囊藻散发出的刺鼻气味会影响周边居民的正常生活，同时有毒微囊藻水华产生的毒素将影响人类的生产生活用水[4 ~5].

　　微囊藻在自然水体中极易聚集成群生长，并且组成群体的微囊藻是随机的，数量不等，不同群体的大小差异巨大[6],造成了微囊藻计数困难。现在常用于的藻类计数方法---直接镜检法[7],由于微囊藻群体的影响，以个体计数法和群体计数法都会使得计数存在很大的随机性，不能科学快速地计数出微囊藻数量。一定频率的超声波能使微囊藻群体解体成小群体，因此，现在也有使用以一定频率的超声波处理一段时间后再使用直接镜检法计数[8],但微囊藻处理会造成细胞不同程度的损失，对计数带来误差[8,9 ~12].其他方法包括电子微粒计数法，流式细胞仪，图像分析法，回归方程计数法，TiO2等，都有一定的局限性[9 ~11,13].
　　
　　在一些研究中发现，加热使得微囊藻群体解散成为单个的微囊藻，并不会对微囊藻细胞造成损失[9 ~12].本实验利用这一特性，用水浴加热的方法对微囊藻进行处理，使微囊藻细胞群体解体成单细胞或小群体，方便计数，提高微囊藻计数的精确性。

　　1 实验材料及方法

　　1. 1 实验材料采集地点及时间

　　实验材料取于五一湖水下 0. 4m 的水样，取材时间为 8 月份水华爆发时间，主要藻种为蓝藻门水华微囊藻和铜绿微囊藻。由于采集时间为水华爆发时间，水样中藻细胞密度过大，将采集的水样以稀释后水样在不同温度梯度下水浴加热 5min. 用血球计数板在显微镜（外接成像系统） 40 倍镜下计量单个群体的最大投影面积以及计数区域内的群体数量，同时记录单个细胞的数量。采集时温为 30℃，实验设计 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ 5 个温度梯度，每个梯度做 5 个平行样，每个平行样做4 个装片进行观察取平均值。

　　1. 3 密度计算

　　密度计算公式为 N = Vs·n/Va式中 N 为 1L 水中浮游植物密度（个/L） ; Vs 为定量体积取 1L; n 为计数体积观察的个数； Va 为计数体积。

　　2 实验结果与分析

　　2. 1 群落的解体及藻单细胞数量变化

　　微囊藻群体在经过水浴五分钟处理后，藻液在 30℃ ~70℃之间的温度梯度下单细胞数量如图 1所示。细胞群体数量与大小数量变化如图 2 所示。实验结果显示： 从 30℃开始，微囊藻单细胞数量随着温度的升高而增多，30℃的单个细胞数量 3.

　　15 × 1011个/L,到 60℃达到 139. 2 ×1011个/L. 温度达到 60℃后，群体已经基本消失，再继续升温，藻细胞的数量不再增加，温度过高甚至会导致微囊藻单细胞解体，藻细胞数量减少。因此，微囊藻群体的最适解体温度在 60℃左右。在 60℃左右时，群体已基本解体，微囊藻以单细胞的形式存在，数量基本固定，继续升温反而会导致微囊藻细胞的损失，造成计数的误差。

　　图 2 所示为微囊藻群体最大投影面积在不同温度下的变化趋势。在温度为 30℃时，微囊藻群体最大投影面积达到 12500μm2,群体大小没有规律，不同大小的群体均存在。当温度达到 50℃时，微囊藻群大小主要集中在 500 ~2500μm2范围内，并且群体数量呈下降趋势。温度 60℃以后，群体数量继续减少，而且没有面积超过 2500μm2的大群体。与之对应的微囊藻单细胞数量随着温度的升高在逐渐的增多（图 1） .随着温度的升高，微囊藻的群体越来越小，大群体数量变少，温度达到 70℃时微囊藻群体群体全部解体为单个藻细胞，并且微囊藻单细胞也开始解体，细胞密度随之减少。

　　2. 2 处理前后对比

　　微囊藻经过水浴处理后，微囊藻群体大小以及单细胞数量有明显的变化，有部分没有完全分散成单细胞的微囊藻群体在水浴后由处理前的多层细胞变为单层细胞，给计数带来了极大的方便。

　　对微囊藻水浴加热后，以传统的镜检法计数，结果显示： 在一定温度（60℃） 内，微囊藻计数相对偏差随着温度的逐渐升高而减小，微囊藻的计数误差在随着水浴温度的升高而降低，当温度达到60℃ 以上时，计数的误差又开始增加，这是由于温度升高后，微囊藻的单细胞开始解体，计数结果比实际结果偏低，造成计数上的误差。

　　3 结论

　　经过水浴处理后的微囊藻基本都由大群体解体成为可计数的小群体，而小的群体则直接解体成为单细胞。因此，在一定的范围内微囊藻群体随着温度的升高解体的越彻底，微囊藻藻液的均匀度在温度升高过程中逐渐升高，微囊藻的计数在水浴加热后变得更加准确。这一方法的实现，突破了以前超声波，OD - 密度法以及直接镜检法等其他方法的一些局限性，为微囊藻计数带来一种新的方法，提高了微囊藻计数准确率，并且该方法操作简单，使用要求低，是一种比较好的方法。在此方法上需要进一步确定更为细小的温度梯度以及更准确的水浴时长实验，实现更为精确的计数。同时需要对更多的微囊藻种类的最佳水浴温度进行试验，使该方法能更广泛地适用于微囊藻计数。

　　参考文献：
　　[1]舒婷婷，陈非洲。 微囊藻群体细胞数量估算的一种简单方法[J]. 生态科学，2011,30（5） : 553 ~555.
　　[2]孙惠群，朱 琳，高文宝。 淡水湖泊中微囊藻水华的成因分析[J]. 生物学通报，2005,40（8） : 23 ~24.
　　[3]尹黎燕，黄家权，李敦海，等。 微囊藻毒素对沉水植物苦草生长发育的影响[J]. 水生生物学报，2010,28（2） : 147~ 150.
　　[4]姜锦林，宋 睿，任景华，等。 蓝藻水华衍生的微囊藻毒素污染及其对水生生物的生态毒理学研究[J]. 化学进展，2011,23（1） : 246 ~ 253.
　　[5]周 伦，鱼 达，余 海，等。 饮用水源中的微囊藻毒素与大肠癌发病的关系[J]. 中华预防医学杂志，2000,34（4） : 224 ~227.
　　[6]陈宇炜，高锡云，陈伟民，等。 太湖微囊藻的生长特征及其分离纯培养的初步研究[J]. 湖泊科学，1999,11（4） : 351~ 356.
　　[7]国家环境保护总局，水和废水监测分析方法编委会。 水和废水监测分析方法[M]. 北京： 中国环境科学出版社，2002.