肿瘤多药耐药(multidrug-resistance,MDR)是指肿瘤对多种结构和作用机制各不相同的化疗药产生交叉耐药,是严重限制化疗疗效、甚至导致化疗失败的一个重要原因。据统计约有90%的癌症化疗失败归因于MDR[2],因此逆转肿瘤多药耐药是肿瘤治疗的一个重要课题。对此国内外众多学者展开了大量研究,部分揭示了MDR的机制,并且筛选出一些对肿瘤多药耐药具有逆转作用的药物。由于西药逆转剂较大的不良反应、中药单味药逆转剂临床应用经验的缺乏等原因,目前能真正应用到临床的MDR逆转剂很少,近年来中药复方逆转剂的研究受到重视。芪竹方在临床实践中对肿瘤的治疗具有增效减毒作用,因逆转耐药为中药增效的机理之一,故推测芪竹方具有逆转肿瘤多药耐药的作用。本研究以消化道常见肿瘤结肠癌及肝癌耐药细胞株为研究对象,探索芪竹方对消化系肿瘤多药耐药的逆转作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系结肠癌耐长春新碱耐药细胞株HCT-8/V、肝癌耐5-FU耐药细胞株Bel/FU、结肠癌非耐药细胞株HCT-8均由南京凯基生物科技发展有限公司提供。
1.2 实验动物SD大鼠,雌雄各半,体重250~300g,健康,由南京凯基生物科技发展有限公司提供。
1.3 方法
1.3.1 芪竹方含药血清的制备SD健康大鼠120只,雌雄各半,体重250~300g,观察3d,精神、毛色等皆正常。随机分为实验组和对照组,实验组大鼠以9.94mg/g剂量的芪竹方灌胃,2次/d,对照组予等体积蒸馏水灌胃,连续3d,末次给药前12h禁食不禁水,末次给药后1h,清醒状态下摘眼球采血,无菌分离血清,经56℃,35min灭活处理后,无菌操作台上用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,置-20℃保存备用。
1.3.2 MTT法检测芪竹方对HCT-8/V及Bel/FU细胞耐药逆转作用实验设6组:芪竹方不同浓度4组(250μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml)、维拉帕米阳性对照组1组、阴性对照组1组,每组5个复孔。取对数生长期HCT-8/V(或Bel/FU)细胞,以1×104/ml密度于100μl培养液中接种于96孔板,在37℃、5%CO2条件下培养过夜后,实验组加入不同浓度的芪竹方和不同浓度(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml)的长春新碱(或氟尿嘧啶),阳性对照组加10μg/ml的维拉帕米和不同浓度的长春新碱(或氟尿嘧啶),阴性对照组仅加不同浓度长春新碱(或氟尿嘧啶),孔板再于培养箱中培养72h,弃上清液,每孔加入50μlMTT(1mg/ml),再置培养箱中孵育4h,小心吸去孔内上清液,每孔加入150μl二甲基亚砜,水平摇床上振荡10min,在ELISA检测仪上于波长490nm处读取光密度值(OD值),求出生长抑制率,以浓度对数为横轴,生长抑制率为纵轴,求浓度与抑制率之间的直线回归方程,计算半数抑制浓度(IC50),并据IC50计算逆转倍数。逆转倍数=实验组IC50÷对照组IC50。
1.3.3 MTT法检测芪竹方含药血清对HCT-8/V及Bel/FU细胞耐药逆转作用实验分以下6组:
10%芪竹方含药血清、20%芪竹方含药血清、10%空白血清对照组,20%空白血清对照组、维拉帕米阳性对照组、阴性对照组,每组5个复孔。取对数生长期HCT-8/V(或Bel/FU)细胞,以1×104/ml密度于100μl培养液中接种于96孔板,在37℃、5%CO2条件下培养过夜后,实验组加入不同浓度(10%、20%)的芪竹方含药血清或空白血清及不同浓度(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml)的长春新碱(或氟尿嘧啶),阳性对照组加10μg/ml维拉帕米和不同浓度的长春新碱(或氟尿嘧啶),阴性对照组仅加不同浓度长春新碱(或氟尿嘧啶),以下步骤同实验1.3.2。
1.4 统计方法
采用SPSS 12.0统计软件进行处理,计量资料以x珚±s表示,组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 芪竹方对HCT-8/V及Bel/FU细胞的耐药逆转作用芪竹方250μg/ml及50μg/ml浓度组可逆转HCT-8/V细胞耐药性(P<0.05),其逆转倍数分别为14.65、6.20;与维拉帕米阳性对照组相比其逆转作用无显著性差异;芪竹方10μg/ml浓度组与芪竹方2μg/ml浓度组对HCT-8/V细胞无耐药逆转作用;芪竹方各浓度组对Bel/FU细胞无耐药逆转作用(表1)。
2.2 芪竹方含药血清对HCT-8/V及Bel/FU细胞的耐药逆转作用20%及10%空白血清无逆转HCT-8/V细胞耐药性作用;芪竹方20%及10%含药血清可逆转HCT-8/V细胞 耐 药 性 (P<0.05),其 逆 转 倍 数 分 别 为6.53、3.01,其中20%含药血清与维拉帕米阳性对照组相比其逆转作用无显著性差异;10%含药血清逆转作用小于维拉帕米阳性对照组(P<0.05)(表2)。
3 讨论
肿瘤多药耐药是一个多机制联合作用产生的结果,肿瘤对一种化疗药物产生耐药性后,对其他多种结构和作用机制各不相同的药物产生广谱耐药现象,导致药物作用不断下降,而逆转多药耐药制剂的使用有助于减缓多药耐药,从而提高化疗效果。
目前认为肿瘤多药耐药与ABC转运蛋白的高表达(如P-糖蛋白)、酶介导的MDR(如谷胱甘肽-S转移酶)及控制凋亡的基因和蛋白的改变等有关,研究的逆转策略主要有运用P-糖蛋白抑制剂、酶抑制剂、细胞因子逆转剂及基因治疗等。尽管有一些化合物在进行临床试验,但到目前为止还没有正式批准应用于临床的肿瘤多药耐药逆转剂,因此寻找低毒、高效、高选择性的MDR逆转剂是当前研究的热点。
中医药用于肿瘤的治疗及辅助治疗已有千百年历史,近年来大量研究显示中药单体及复方制剂通过多靶点、多环节作用于MDR逆转,增强抗肿瘤药物的细胞毒作用,调节机体免疫功能,改善生活质量。
芪竹方由炙黄芪、玉竹等药物组成,是一剂益气养阴、化痰祛瘀、清热解毒的复方,本实验证实对肿瘤细胞无直接杀伤作用浓度的芪竹方及其含药血清具有逆转某些肿瘤多药耐药的作用,由此可认为益气养阴、化痰祛瘀、清热解毒法可能具有逆转肿瘤多药耐药的功效,并逆推肿瘤多药耐药的形成可能与气阴不足、痰结血瘀、热毒炽盛有关,其分子生物学机制有待于进一步深入的研究。
本课题的研究对象是消化系的两种肿瘤细胞株———HCT-8/V及Bel/FU,芪竹方及其含药血清只对HCT-8/V细胞有耐药逆转作用,推测其原因是HCT-8/V与Bel/FU有着不同的耐药机制,有待于进一步证实。药物逆转的具体作用靶点、凋亡途径、信号转导通路及与化疗药物的协同作用等尚需进一步研究,相信随着肿瘤临床及分子生物学的发展,中药复方制剂逆转多药耐药的机制将被阐明,为临床用药提供指南。
综上所述,芪竹方及其含药血清能体外逆转结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/V的耐药性,而对Bel/FU细胞无体外逆转作用。
