通光藤抗肿瘤的化学成分分析

　　通光藤始载于《滇南本草》，为萝藦科植物通光散 Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn.的干燥茎、藤、根、叶，具有止咳平喘、消炎镇痛、利乳通尿等功效。现代药理及临床研究结果表明，通光藤具有显著的抗肿瘤活性，对胃癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤具有确切的临床疗效，目前在通光藤中分离得到的化学成分包括 C21甾体类、多糖类、环醇类和三萜类等 40 多种。为进一步阐明通光藤抗肿瘤作用的物质基础，本研究对通光藤有效部位中的主要化学成分进行了提取分离和体外抗肿瘤活性研究。

　　1、 仪器与材料

　　通光藤药材产地为云南建水，经南京中医药大学鉴定教研室陈建伟教授鉴定为萝藦科植物通光散 Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn.

　　的干燥茎、藤。AC-500 型核磁共振仪(瑞士BRUKER 公司)；X-4 型显微熔点测定仪(河南豫华仪器有限公司)；D101 大孔吸附树脂(天津农药树脂有限公司)；200-300 目柱层析硅胶(青岛海洋化工分厂)。人癌细胞株：HepG2(人肝癌细胞株)，ISMMC-7721(人肝癌细胞株)，MGC-803(人胃癌细胞株)，BGC-823(人低分化胃腺癌细胞株)，A549(人肺癌细胞株)，NCI-H460(人大细胞肺癌细胞株)，Eca-109(人食道癌细胞株)，CaEs-17(人食道癌细胞株)，以上细胞株均由南京中医药大学海洋药物中心药理毒理室细胞库提供。DM1L 型倒置显微镜(德国莱卡公司)；SW-CJ-ZFD 型超净工作台(苏净集团安泰公司)；Powerwave340 型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；3111 型 CO2孵箱(Thermo)；96 孔培养板(Corning)；RPMI-1640 培养基(美国Invitrogen 公司，批号：20110313)；新生小牛血清(FCS，中美合资兰州民海生物工程有限公司，批号：20110621)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Amresco公司，批号：20101203)；胰蛋白酶(Amresco 公司，批号：20110112)。

　　2、 方法与结果

　　2.1 提取分离

　　通光藤干燥药材 20 kg，经适当破碎，15 倍量95%乙醇回流提取 2 次，合并提取液，回收乙醇，所得浸膏分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取正丁醇层提取物 200 g 进行硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，各流份反复分离、纯化，得到化合物 1~3，重量分别为 15，8，32 mg。

　　利用核磁共振波谱学方法进行结构测定。

　　2.2 结构鉴定

　　化合物 1：mp142~143 ℃。1H-NMR (300 MHz，C5D5N)：4.75(2H，d，J=4.5 Hz，2，3-H)，4.99(2H，d，J=2.6 Hz，4，1-H)，6.20(2H，br s，5，6-H)。13C-NMR(C5D5N)：130.9(5-C，6-C)，74.7(2-C，4-C)，70.9(1-C，3-C)。经与文献对照，波谱数据一致，鉴定为牛奶菜醇(环己烯四醇，conduritol)，结构式见图 1。

　　化合物 2：mp 156~158 ℃。1H-NMR(300 MHz，DMSO)中，δ4.8~0 可见 32 个质子信号，结合13C-NMR(DMSO)21 个碳信号，其中包括 δ211.1羰碳，δ90~60 间 5 个连氧碳，δ55~0 间 15 个饱含烷烃信号，初步推测为 C21甾体类化合物。1H-NMR：δ0.90(3H，s)，1.02(3H，s)提示为甾体母核 18，19 甲基信号，δ2.18(3H，s)给出另外一孤立甲基信号，且应与 sp2 杂化碳相连，δ4.38(1H)、4.38(1H)、4.13(1H)在 HSQC 中无法找到碳信号的归属，且在 HMBC 谱中与分别与 δ73.0，68.9，65.2这 3 个连氧碳远程相关，提示为甾核 3 个羟基质子信号；δ：70.9，69.3 连氧碳在 HMBC、HSQC谱中均找不到相关点，提示具有环氧结构。综合以上分析，并对照文献[3]中报道的波谱数据，确定该结构为通光藤苷元 B。此苷元为在植物中首次分离得到，以往的报道均为皂苷水解获得，波谱数据见表 1，结构式见图 2。

　　化合物 3：mp156~158 ℃，1H-NMR(300 MHz，C5D5N) δ1.16(3H ， s ， C19-CH3) ， 1.42(3H ， d ，J=6.3 Hz，C21-CH3)，1.48，1.55，1.59(各 3H，d，J=6.3 Hz，糖上 C6-CH3)，1.86(3H，s，C18-CH3)，3.58，3.61，3.88(各 3H，s，糖上 3 位-OCH3)，4.43(1H，q，J=6.1 Hz，C20-H)，4.71(1H，d，J=7.5 Hz，糖上端基 H)，5.10，5.19(各 1H，dd，J=10.0，2.0 Hz，糖上端基 H)，表明有 2 个去氧糖，且 3 个糖均为β 构型。将化合物的光谱数据与文献报道[4]对照，其1H-NMR、13C-NMR 数据与大叶牛奶菜苷丁(marsdekoiside D)完全一致，故确定其结构为大叶牛奶菜苷丁，波谱数据见表 2，结构式见图 3。

　　2.3 抗肿瘤活性

　　称取化合物 1~3 各 100 mg，加入 1 mL 生理盐水，3 000 r·min-1离心 10 min·L-1，吸取上清液，浓度为 100 mg·mL-1，用培养液依次稀释至2.5 mg·mL-1，250，25 ?g·mL-1备用。MTT 法测定化 合 物 1~3 样 品 对 HepG2 、 ISMMC-7721、MCG-803、BGC-823、A549、NCI-H460、Eca-109、CaEs-17 8 种细胞株增殖的影响，以肿瘤细胞抑制率为指标观察其抗肿瘤作用，计算 IC50，结果见表 3。

　　3、 讨论

　　通光藤的抗肿瘤疗效确切，但其抗肿瘤活性物质基础研究工作报道较少。本次实验在通光藤的主要活性部位中提取得到了 3 个化合物，分别为 C21甾体类和环醇类。通过体外抗肿瘤活性筛选研究结果表明，C21甾体类化合物(2，3)对 7 种人癌细胞均有显著的抑瘤活性(P<0.01)；说明通光藤C21甾体类化合物具有明显的抗肿瘤活性。对BGC-823 瘤株作用不明显，可能与 BGC-823 细胞株为低分化型腺癌有关。本次研究首次在通光藤植物中得到了通光藤苷元 B，并证明了其抗肿瘤活性，说明通光藤 C21甾体类抗肿瘤的药效团在于其苷元部分，其构效关系有待深入研究。