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牡丹杂交育种花粉管处理研究材料与方法

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2015-02-10 共1879字
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  第二章 研究材料与方法

  2.1 实验材料

  用于杂交的中原牡丹品种有:‘凤丹白’(‘Feng Dan Bai’)、‘朱砂垒’(‘Zhu Sha Lei’)‘墨池争辉’(‘Mo Chi Zheng Hui’)(图 2-1a、b、c)由中国林业科学研究院玉泉山牡丹基地提供,该基地以上 3 个品种自然结实力较强,栽培面积较广。滇牡丹(P.delavayi)(图 2-1d)取自于滇西北香格里拉县城以西 25 km 左右的滑雪场附近(27°57′N,99°35′E),是目前我们调查发现的滇牡丹最集中、花色最丰富、面积最大的分布区域(李奎,2012)。

  本区属温带高原半湿润季风气候,海拔 3318 m,年平均气温 5.9 ℃,最冷月平均气温-0.4 ℃,最热月平均气温 13.3 ℃,无霜期 123.8 d,年降水量 648.6 mm,年蒸发量 1616.8mm,年日照时数 2155.9 h,年平均相对湿度 69%,10 ℃以上积温 1539.2 ℃(以上气象数据来源于迪庆州气象局)。
  
  2.2 试验方法

  2.2.1 花粉采集及花粉活力的测定
  
  2013 年 4 月份于北京采集玉泉山中原品种‘凤丹白’、‘墨池争辉’、‘朱砂垒’初开花朵中的花药,此时的雄蕊成熟,将其带回室内阴干,收集散出的花粉,装入有硅胶的瓶中,置于 4℃冰箱内贮藏备用。将采集来的花粉以及保存在-80 ℃的滇牡丹花粉参照律春燕等(2009)方法,进行花粉活力的测定。花粉离体萌发法的试验方法为在双孔凹型载玻片孔内滴入 0.1 mL 的花粉培养液,将花粉均匀地点入培养液中,将载玻片放入保湿的培养皿内,置于 25 ℃人工气候箱中光照培养 4 h。在 40 × 显微镜下观察统计,每处理统计 10 个视野,每个视野花粉不少于 50 粒,至少 3 个重复。实验数据使用 SPSS 12.0进行处理。

  2.2.2 人工套袋及去雄

  在母本花蕾风铃期或露色期用镊子或徒手将花瓣和雄蕊掐掉或撕掉,去雄完全的母本用硫酸纸袋套在花头上并用回形针将袋口轧紧,避免风媒或虫媒将其他花粉带到柱头上影响授粉结果。

  2.2.3 实验材料杂交组合及授粉方法处理【1】

论文摘要

  
  2.2.3.1 切割柱头或花柱授粉和切割柱头和花柱+花粉培养液授粉
  
  分别选取北京玉泉山基地的‘墨池争辉’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉,参照李奎等(2013)柱头可授期时间和研究方法。具体授粉方式分如下几种:1.正常柱头授粉(CK);2.仅切割柱头后授粉;3.切割全部花柱后授粉;4.将花粉授于正常柱头上,缠上浸有花粉培养液的脱脂棉,并包上保鲜膜;5.仅切割柱头后授粉,缠上浸有花粉培养液的脱脂棉,并包上保鲜膜;6.切割全部花柱后授粉,缠上浸有花粉培养液的脱脂棉,并包上保鲜膜。切割柱头或花柱的做法是用刀片削去柱头或花柱。每种授粉方式授粉 70 朵花,其中 20 朵花用于留种,授粉后,挂牌标记杂交组合、授粉时间。

  花粉培养液配方为:150 g?L-1蔗糖+H3BO330 mg?L-1+CaCl220 mg?L-1,此配方参考律春燕(2010)的花粉培养液配方。

  花粉管生长状态观察:授粉后的 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时,分别取下 10 个心皮,放入 FAA 固定液中固定,于 4℃冰箱里保存。样品均用 8 mol· L-1NaOH 溶液软化处理,用蒸馏水反复冲洗后,用 0.1% 脱色的水溶性苯胺蓝溶液染色 5~10 h,压片(Kho YO & Bear J,1968),置于 300~400 nm的荧光显微镜(ZeissAxioskop 40)下观察花粉粒的萌发、花粉管进入柱头及其在花柱中的生长情况,并进行拍照记录,参照关军峰等(1999)的方法进行花粉管长度统计,所得数据用 SPSS 12.0 进行统计分析。

  2.2.3.2 激素处理

  分别选取北京玉泉山基地的‘朱砂垒’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉,处理方法是:先配好浓度均为 0.1mg?L-1的 3 种激素 BA、GA3、NAA,,具体授粉方法为以下几种:1.不做激素处理(CK);2.将花粉直接授在柱头上,缠上浸有BA 激素的脱脂棉,并包上保鲜膜;3.将花粉直接授在柱头上,缠上浸有 GA3激素的脱脂棉,并包上保鲜膜;4.将花粉直接授在柱头上,缠上浸有 NAA 激素的脱脂棉,并包上保鲜膜。授粉后,立即用硫酸纸袋将柱头保护起来,防止风或昆虫将其他的花粉带到柱头上。每种授粉方式授粉 70 朵花,其中 20 朵花用于留种,授粉后,挂牌标记杂交组合、授粉时间。

  花粉管生长状态观察同 2.2.3.1。2.2.3.3 自交和杂交授粉试验方法:分别选取北京玉泉山基地的‘凤丹白’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉,授粉分以下 3 种情况‘凤丹白’自交、‘凤丹白’×滇牡丹、滇牡丹ב凤丹白’。每种授粉方式授粉 70 朵花,其中 20 朵花用于留种,授粉后,挂牌标记杂交组合、授粉时间。

  花粉管生长状态观察同 2.2.3.1。

  2.2.4 结实情况统计

  对以上 3 种授粉处理方式的 3 个杂交组合的结实情况进行统计,统计方法参考 Li 等(2013)。结实率=种子数/授粉朵数,采用 SPSS 12.0 软件对统计结果进行分析。

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