氮素对观赏植物的作用研究试验材料与方法

　　2试验材料与方法。

　　2.1试验材料。

　　供试观赏植物的选择：

　　芒、Miscantkus sinensis、：禾本科多年生华状草本植物，近年来是新兴起的观赏草类之一。过去对芒的研究多集中在能源材料上，而近几年开始研究其对环境的适应性，以耐旱和耐荫性为主，而对作为观赏草之一的芒进行氮素营养方面的研究少之又少。

　　银边吉祥草CReineckia camea WIK variegata）：百合科吉祥草属多年生草本植物，虽然原产于我国，但是园林应用方面极少，近一两年在市场上经常看到其出现，通过资料査阅发现对其生理研究的人参寥无几，只有部分资料显示对其园林应用的调查，故推测这是一种前景优秀的园林地被植物，对其进行氮素养分的研究。

　　千日红（Gomphrenaglobosa）：宽科千日红属一年生草本植物，对于千日红的研究多集中在组培、色素、栽培、病虫害等方面，在营养方面为缺乏某一种元素和复合施肥的研究，可见对于单一营养的研究是缺乏而有必要的。

　　半支莲（-Portulaca grandiflora）-.马齿觅科马齿苋属一年生草本植物，对其的研宄多集中在育种、栽培、药用价值等方面，其园林应用过于普遍，己经应用了很多年，但在其花坛中种植后，后期施肥方面的研宄缺乏。

　　由于同一个苗木市场植物材料种类不全，故分别购于福州市建新花舟市场和江苏省沐阳县春彩花丼苗木市场。

　　2.2试验设计。

　　试验与2013年4月1日到9月1日在福建农林大学科技园2号楼和田家炳试验楼进行。

　　4月1日买植物材料种植于塑料大棚中，待六七月长至快成熟的时候蹄选生长一致的植株进行试验处理，将四种植株分别种植于33cmX28cmX31.5cm的花盆中，每盆放入2kg的黄心土，分别拌入0.5kg的石英砂用于透气，每盆1到2株，按植株的大小来定。

　　试验采用双因素随机区组设计。设4个处理，每个处理2株/盆，三个重复。处理设置如下：

　　设置的4个浓度梯度分别为。

　　No （无氮）：氯化钾l.Ommol/L、磷酸二氢钠0.25 mmol/L.

　　N]（低氮）：硝酸韩0.1 mmol/L>硝酸钾0.1 mmol/L>氯化钟1.0 mmol/L、硝酸铵0.5mmol/L、怜酸二氢钠 0.25 mmol/1.

　　N2 （中氮）：硝酸钱1.0 mmol/L、硝酸钾1.0 mmol/L、氯化钾1.0 mmol/L、硝酸铵0.5mmol/L、怜酸二气钠 0.25 mmol/1.

　　N3 （高氛）：摘酸韩10、确酸钾10 mmol/L、气化钾1.0 mmol/L、硝酸铵0.5 mmol/L、怜酸二氢纳0.25 mmol/L.其中以CaClz调节兴浓度为1.5_ol/l,各处理中微量元素的含量相同（mmol/L）：梓檬酸铁0.05、硫酸镁1.0、硫酸猛0.005、硫酸铜0.0005、硫酸锋0.0005、硼酸0.01、钼酸铵0.0001、氯化纳0.05.

　　待营养液配置好后，每周饶一次营养液，每盆加入0.5L的溶液，每周取一次植物材料进行生理指标的测量，并进行形态的观测。

　　2.3研究的主要技术手段。

　　以园林绿地中的四种观赏植物为研究对象，分别以氮素浓度和时间梯度进行处理，浓度梯度设置为高、中、低三种浓度，以不施氮素为对照，分别研宄其观赏效果在不同浓度不同时间变化下的影响。

　　通过测量其某些生理和形态指标，分析不同浓度的氮素对其是否有显着性影响，通过不同指标变化程度的综合影响，最终得出后期最佳施加氮素的浓度并得出四种园林植物在氮素利用率的高低比较。

　　2.4指标的测量。

　　2.4.1形态指标的测量。

　　（1）叶长生长量：直尺测量。

　　叶长生长量（cm）=本阶段叶长-上一阶段叶长。

　　（2）株高生长量：直尺测量。

　　株高生长量（cm）=本阶段株高-上一阶段株高。

　　2.4.2生理指标的测定叶绿素含量、可溶性蛋白、丙二酸（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物，（POD）。

　　（1）叶绿素含量的测定。

　　准确称取0.05g植物鲜材料剪碎，加入5ml体积比丙酮：乙_醇=1:1的提取液在暗中浸提12h后，用紫外分光光度计分别测量在波长为663mn和645mn下的吸光值。

　　叶绿素 a Cmg/g） =0.005x（12.71A663-2.59A645）/0.05叶绿素 b （mg/g） =0.005x（22.88A645-4.67A663）/0.05叶绿素总量（mg/g）=叶绿素a+叶绿素b（2）可溶性蛋白测定。

　　溶液的配制：

　　①标准蛋白质溶液：100_1牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定溶至100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸馆水稀释至100ml即可。

　　②考马斯亮蓝G-250溶液：称取lOOmg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml90%乙醇中，加A 100mI85% （W/V）的怜酸，在用蒸馏水定溶到1L,藏于棕色瓶中。常温下可保存一个月。

　　实验步骤：

　　取6支具塞试管，按表2-1加入试剂（O-lOO^g/ml的标准蛋白）。混合均匀后，向各试管中加入5inl的考马思亮蓝G-250溶液，摇匆，并防止5min左右，用1cm的光径比色皿在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

　　样品的测定：

　　①样品的提取。称取鲜样0.5g,用5mL的超纯水研磨成勾聚后，lOOOOr/min离心lOmin,去上层清夜1.0ml于试管中。

　　②吸取样品提取液Iml,放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马思亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595ran下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

　　C为査标准曲线值，ng; Vt为提取液总体积，ml; Wp为样品鲜重，g; Vs为测定时加量，ml.

　　（3）丙二酸（MDA）含量测定。

　　准确称取0.2g植物鲜材料剪碎，至于预冷过且于冰上的研钵中，加入4inL的0.05mol/L,pH7.8怜酸缓冲液（分两次加入）和少许石英砂进行研磨，研磨成句浆后转移到离心管中，放入离心机以4°Cl3000r/min离心20min,提取酵液。将酶液放入4“C冰箱中保存待用。以下各生理指标测定均用此液。

　　吸取酶液1.5ml （对照为1.5mL的怜酸缓冲液），加入2.5ml0.5%硫代巴比妥酸和5%的三氯乙酸溶液于沸水浴中加热15min,反应完成后迅速置于冷水中冷却，冷却后将反应后的液体转移到离心管后以1800r/min于冷冻离心机中离心lOmin,于532nm、600nm和450nin波长下测定吸光度。

　　丙二醛含量（μmol/gFW） =（6.45×（A532-A600）-0.56A450） ×V/W.

　　FW为鲜重；V-提取液总量（2ml〉； W-材料鲜重（0.5g）。

　　（4）超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定。

　　反应体系见表2-2,共两支对照管，A管和B管，对照管的酶液均用0,1ml PH7.8 PBS代替，混勾后将A管置于暗处，作为空白对照调零，其余各管置于4000IX日光灯下反应ISmin,要求各管光照情况一致。然后立即置于暗处终止反应。分别测定其他各管在560nm处的吸光度。以鲜重酶单位每克表示（U/gFW_h_i）。

　　SOD _活性=（Ack-A56O） ×V/ （AcK×W×Vt×50%）。

　　注：Aoc为B管在560nm处吸光度值。

　　Aseo为样品管在560nm处吸光度值。

　　V为提取酶液的总体积（4mL）。

　　W为提取酶液的植物样品鲜重（0.2g）。

　　Vt为测定时加入酶液的体积（O.lml）。

　　（5）过氧化氢酶（CAT）活性测定。

　　取lOmL试管3支，分别标号为A、B、C,其中A为对照空白管，其余两只为样品测定管。各管分别加入pH=7.8, 0.05moI/L的PBS 3ml,待测酶液0.1ml.将A管在沸水浴煮Imin以杀死酶液，冷却。最后将所有试管在25°C下预热5min后，逐管加入O.lmol/L的H2020.9ml,每加完一管立刻计时，并摇勾迅速倒入石英比色皿中，在240mn下测定吸光度值，每隔Imin读数1次，共测4min,待3支试管全部测定完后，计算酶活。以Imin内A240减少0.1的酵量为1个酶活单位U （u/min.g）。

　　CAT 活性=（△A240×V） / （W×Vt×O.Ol×t）。

　　注：V为酶提取液的总体积。

　　W为提取酶液的样品鲜重（0.2g）。

　　Vt为测定时加入酶液的体积（0.1ml）。

　　t为反应时间（min）。

　　（6）过氧化物酶（POD）活性的测定。

　　酶活性测定的反应体系包括：0.05niom、pH=6.0怜酸缓冲液2.9ml,2%H202 1ml、0.05mol/L愈创木酸1ml,最后加入酶液0.1ml以启动反应。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即置于34°C水浴中保温3min,然后470nm波长下测定吸光度。测定4分钟，每分钟测一次。酶活力以1min内△A470变化0.01为1个酶活性单位，以△A470/（min·gFW）表示。

　　POD 活性=（△A470×V） / （W×Vt×O.Ol×t）。

　　注：△A470为反应时间内吸光度的变化值。

　　V为酶液提取的总体积。

　　W为提取酶液的植物样品鲜重。

　　Vt为测定时加入酵液的体积。

　　2.5分析方法。

　　Excel2003和DPS7.05软件，LSD法，模糊综合评价法，即用模糊数学对受到多种因素制约的事物或对象做出一个总体的评价。它具有结果清晰，系统性强的特点，能较好地解决模糊的、难以量化的问题，适合各种非确定性问题的解决。

　　本试验通过隶属函数的方法来确定各指标之间的模糊关系，从而对多个指标进行综合评价，得到最终的结果[45].计算公式如下：

　　①用下式计算每个品种所测指标的隶属函数值：

　　R（Xi）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）    公式（1）。

　　式中，X为指标测定值，Xmin和Xmax分别为所有参试材料某一指标的最小值和最大值。

　　②如某一指标与该性状呈负相关，其隶属函数值可用反隶属函数来计算：

　　R（Xu） =l-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmm）       公式（2）。

　　③把每一品种各指标的隶属函数值相加，并求其平均数。平均数越大，氮素浓度越佳或者该种植物对氮素利用效率越高。