探究山桃的抗根癌病种质资源价值

　　桃是我国重要的落叶果树,截止2007年,栽培面积已达71.28万hm2,总产量803.2万t,栽培面积和产量均居世界首位①,在我国果树生产中占有十分重要的地位。根癌病主要危害桃树的主根、侧根及主干基部,被侵染部位细胞恶性分裂而形成肿瘤,导致输导组织紊乱,养分水分运输受阻,植株生长缓慢,叶片黄化,产量降低,果实品质下降,甚至整株死亡,对桃树苗木及桃果生产危害十分严重,是重要的检疫病害。根癌菌寄主范围广泛,除木本植物以外,亦可侵染草本植物,许多林地、果园乃至种植粮食作物的耕地土壤均有分布,在这些土地上繁育桃苗或建立桃园都有可能发生严重的根癌病危害。

　　桃 树 根 癌 病 的 病 原 菌 为 发 根 土 壤 杆 菌(Agrobacterium rhizogenes)和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens),可通过灌溉水、果园耕作机械和苗木调运远距离传播。该病原菌一旦侵入植物体内就很难被杀死,即便病原菌被彻底消灭,被侵染植物亦会形成癌肿病导致严重危害。因此,根癌病的防治一直是一个难以解决的问题。

　　植物检疫是防止根癌病跨省传播的主要途径,但由于我国果树苗木生产经营过于分散,检疫环节也不能有效防止根癌病的传播。在生产上,用硫酸铜溶液、石灰水或生防菌蘸根是防止根癌病发生的常用方法,但铜离子容易导致桃树的生理病害,生防菌的应用成本较高。切除肿瘤是迄今为止果树根癌病治疗的唯一有效方法,但复发率很高,必须辅以伤口涂抹硫酸铜、石硫合剂、福美砷和生防菌等提高疗效。此法不仅工作量大,而且铜离子会导致环境污染。因此,选育抗根癌病砧木品种才是桃树根癌病防治的既经济高效又环境友好的途径与方法,而要选育抗病型砧木品种,就必须对桃树砧木种质资源树种进行抗根癌病性能评价,以找到优良抗型植株。

　　山桃(Prunus davidiana(Carr.)Franch)广泛分布于我国山东、山西、河北、河南、陕西、甘肃、四川及云南等省区,是我国传统的主要桃树砧木树种之一。山桃耐旱性、抗寒性强,以其为砧木嫁接的桃树树势中庸健壮、结果早、产量高,所结果实口味纯正,具有独特的开发利用潜质。本研究旨在探明山桃的抗根癌病种质资源价值,为培育抗根癌病桃树砧木优良品种提供部分科学依据。

　　1 材料与方法

　　本研究于2012—2013年在中国农业大学上庄实验站8号日光温室内进行。

　　1.1 试验材料

　　一年生山桃实生苗250株,苗干粗3mm以上。

　　种子购于陕西省渭南市。沙藏90d后播于12cm×12cm的营养钵内。基质由田园土、蛭石、草炭体积比1∶1∶1混合而成,经121 ℃高压灭菌20min。

　　钵苗在日光温室内养护。

　　本实验室从感染根癌病的桃树根部瘿瘤上分离、鉴定和保存的Ap10(发根土壤杆菌)和Ap2(根癌土壤杆菌),分别配成108cfu/mL的悬浮液。用以鉴定菌株致病性的向日葵苗20株,株高约15cm,穴盘培养,栽培基质同山桃。

　　1.2 山桃接种

　　将供试植株依次编号、挂牌、登记。

　　120株接种发根土壤杆菌,120株接种根癌土壤杆菌,另10株接种无菌水为对照。每株接种3个位点,相邻位点距离1.5cm左右。接种前先用70%酒精擦拭接种部位,再用一次性7号注射器注入1滴菌液。接种深度以针头触及木质部为准。接种后用蘸有菌液的脱脂棉包扎伤口保湿1周。接种后的山桃苗在温室内养护,室内温度25~35℃。

　　1.3 病原菌致病性检测
　　
　　取10株向日葵苗苗茎针刺接种发根土壤杆菌,另10株接种根癌土壤杆菌,方法同1.2。接种后10d,接种部位全部形成瘤状突起。

　　1.4 抗性评价

　　接种后70d,以株为单位用游标卡尺测量肿瘤+枝条直径和肿瘤上方枝条的直径,两者之差即为瘤茎大小。

　　根据单株最大瘤茎分别评价山桃对发根土壤杆菌和根癌土壤 杆菌 的群体抗性和 群 体 抗 性 分 离情况。病级划分标准:根据株最大瘤径大小,将供试植株的发病轻重分为6个等级。0级未发病,接种部位突起<1.0mm,与对照无明显差异;1级瘤径1.0~3.0mm;2级瘤径3.1~5.0mm;3级瘤径5.1~7.0 mm;4级瘤径7.1~10.0 mm;5级瘤径>10.0mm。

　　群体抗性评价标准:根据病情指数大小,将山桃对根癌病群体抗性分为6个等级。免疫,病情指数为0;高度抗病,0<病情指数≤20;中度抗病,20<病情指数≤40;低度抗病,40<病情指数≤60;感病,60<病情指数≤80;易感病,病情指数>80。

　　病情指数=∑(病级×同病级株数)最高病级×调查总株数×100群体抗性分离情况分析:根据株最大瘤径大小和个体抗性分级标准,逐一确定供试植株的个体抗性,再根据个体抗性评价结果统计分析山桃实生群体对2种根癌菌的抗性分离情况。

　　个体抗性评价标准:根据株最大瘤径大小将个体抗性分为6个等级。免疫,未发病,接种部位突起小于1mm,与对照无明显差异;高度抗病,瘤茎1.0~3.0mm;中度抗病,瘤茎3.1~5.0mm;低度抗病,瘤 茎5.1~7.0 mm;感 病,瘤 茎7.1~10.0mm;易感病,瘤茎≥10.0mm。

　　2 结果与分析

　　向日葵苗接种鉴定结果表明,本次评价所使用的2个菌株Ap10和Ap2具有良好的致病性;与接种的240株山桃苗一起养护的10株对照山桃苗均未发病,表明本次试验未受其他根癌病菌的污染。

　　2.1 山桃对发根土壤杆菌的抗性

　　试验结果显示(表1),接种后70d,120株山桃实生苗的株最大瘤茎为0~20.3mm,0、1、2、3、4和5级病株数分别为25、6、15、14、24和36株,病情指数为59,根据抗性评价标准判定其为低抗发根土壤杆菌型树种。个体抗性评价结果表明,实生山桃对发根土壤杆菌的抗性存在广泛的株间分离现象,其中存在免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病全部6种抗性类型,120株供试植株中有免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病型25、6、15、14、24和36株,分别占群体总数的20.8%、5.0%、12.5%、11.7%、20.0%和30.0%(表2)。【表2】

　　
　　2.2 山桃对根癌土壤杆菌的抗性

　　试验结果显示(表3),接种后70d,120株山桃实生苗的株最大瘤茎为0~5.3mm,0、1、2和3级病株 数 分 别 为42、67、10和1株,未 出 现4级和5级病株,病情指数为15,根据抗性评价标准判定其为高 抗根癌土壤杆菌 型 树 种。个 体 抗性评价结果表明,实生山桃对根癌土壤杆菌的抗性存在显着的株间 分离现象,其中存在免疫、高抗、中抗和低抗4种抗性类型,120株供试植株中有免疫、高抗、中抗和低抗型42、67、10和1株,分别 占 群 体 总 数 的35.0%、55.8%、8.4%和0.8%(表4)。【表4】

　　
　　3 讨论

　　一套合理完善的评价体系是进行抗根癌病评价工作的前提。该体系包括以下几个方面:

　　1)首先是接种用的根癌菌要有良好的致病性。由于根癌菌的致病性是由其体内致癌质粒上的致癌基因,而非染色体上的基因所决定,在繁殖过程中,有相当一部分的后代体内会失去致病质粒而失去致病性,随着繁殖代数的增加,菌群中致病性个体所占比例越来越低,群体致病性越来越弱,乃至消失。因此,在对植物抗病性评价或鉴定接种前,必须对病原菌进行致病性鉴定。

　　2)其次是评价内容、评价材料与群体大小的确定。多数研究者只评价某种植物对根癌菌的群体抗性,而忽视了个体抗性和群体抗性分离情况,这样评价的结果会导致研究成果的理论与应用价值均大幅度降低;评价某一种植物的抗性要选择有一定代表性的实生群体,而不是来自某一个或几个特殊的植株,亦不可是无性繁殖的群体,以保证评价结果的客观性;被评价植物群体数量大小,是关乎评价结果客观性的另一重要因素,群体数量越小,评价结果的客观性越差,数量越大,则评价结果的客观性越好;但群体数量过大,则评价工作量越大,成本也越高。根据多年多树种抗性评价工作,认为群体数量以100~150株为宜。

　　3)选择合适的接种方法以及接种后的养护环境与养护时间。常见的接种方法有刀片划伤苗茎,然后用棉花蘸取菌液包裹伤口,或者人为在植株根部造成伤口后用菌液浇灌。但前者操作复杂,伤口长度、深浅、接种量不易控制,后者不利于调查和观察肿瘤生长状态。相对来说,针刺接种嫩梢的方法操作简单、肿瘤形状较规则,便于调查。而且新稍对根癌菌侵染比根部更敏感,能更好地反应植物对根癌病的抗性。接种后的空气湿度和温度对病原菌的侵染和癌瘤的形成与发育影响很大。研究表明,在较高的适度条件下,根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌在30min内即可侵染毛桃和山桃。因此,接种后保湿5~24h已足够保证病原菌的正常侵染,在高温季节用棉球外包保鲜膜保湿一周,有时会导致其他病原菌侵染而影响评价结果的客观性。此外,即使在适宜的环境条件下,肿瘤的发育也需要一定的时间,随着时间的推移,抗性不同的植株接种部位肿瘤大小的差异逐渐加大,只有接种后的时间达到一定的长度后,被评价群体内的个体抗性差异才能充分表现出来。因此,接种后养护时间过短,则会导致评价结果的客观性降低,接种后的养护时间以60~70d为宜。

　　4)最后是病级划分指标与抗性等级的确定。植物抗根癌病性能评价中首先要确定病级和个体抗性划分指标,以往的研究常采用接种发病率、肿瘤数量、肿瘤大小或质量、平均瘤径等。以株最大瘤径为病级和个体抗性划分指标具有简单、客观、可操作性强等特点。前人在评价中国野生葡萄对根癌病的抗性时把抗病性分为4个等级:高抗、中抗、中感、高感;在此基础上有研究将评价标准拓展到免疫、高抗、中抗、感病、易感病5个等级;很显然,这种划分还有一定的缺陷。因此,本研究沿用了免疫、高抗、中抗、低 抗、感 病 与 易 感 病 六 级 划 分方案。

　　4 结论

　　山桃低抗发根土壤杆菌、高抗根癌土壤杆菌,其实生群体对2种根癌菌的抗性均存在广泛的株间分离现象。其对抗发根土壤杆菌的抗性分离为免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病6种类型,每种抗型植株分别 占群体总 数 的20.8%、5.0%、12.5%、11.7%、20.0%和30.0%;其对根癌土壤杆菌的抗性分离为免疫、高抗、中抗和低抗4种类型,分别占群体总数的35.0%、55.8%、8.4%和0.8%。山桃中存在大量发根土壤杆菌和根癌土壤杆菌免疫型植株,是极优异的抗根癌病种质和基因资源树种。

　　参考文献
　　
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