用作绿僵菌分离的真菌抗生素筛选试验

　　绿僵菌( Metarhizium spp． ) 是一类重要的昆虫致病真菌，被广泛应用于农林害虫防治。土壤是绿僵菌宿存的重要场所，是绿僵菌资源的主要来源渠道，但因土壤中的大量非目标真菌，如黄曲霉( Aspergillus flavus) 、黑曲霉( A． niger) 、毛霉( Mucor racemosus) 等与绿僵菌的生长条件相近，而且生长速度比绿僵菌快，常导致绿僵菌分离过程中大面积污染，影响分离效率。绿僵菌在土壤中的宿存和持续控制害虫能力等研究中均涉及到从土壤中分离绿僵菌的过程，统计施放绿僵菌后的种群时空动态，需能有效分离但不抑制绿僵菌生长的分离培养基，并能保证分离过程中绿僵菌的生长不受非目标菌的影响。

　　因为生长条件和营养条件相似，真菌污染在绿僵菌分离过程中较易发生，在分离培养基中添加抗生素是控制绿僵菌污染的有效方式［1］。目前市场上真菌抗生素主要有氨基糖苷类抗生素，如井冈霉素和春雷霉素; 核苷类抗生素，如武夷菌素、多抗霉素、宁南霉素等; 四环素类抗生素，如金霉素和土霉素; 多烯类抗生素，如近年来应用较多的放线菌酮和两性霉素 B 类; 大环内酯类抗生素，如梧宁霉素; 多醚类抗生素，如莫能菌素［2-3］。

　　本研究以土壤中 6 种非目标优势真菌和 2 种绿僵菌为供试菌，评价了 3 种真菌抗生素对目标菌和非目标菌的抑制作用，旨在筛选出对土壤中的优势真菌有较好抑制效果但不影响绿僵菌生长的抗生素种类和浓度，用于绿僵菌的分离。

　　1 材料与方法

　　1． 1 供试药剂与供试菌株

　　供试药剂有伊曲康唑( 西安杨森制药有限公司生产) 、两性霉素( Amresco 公司生产) 、放线菌酮( Sigma公司生产) 。供试菌株有金龟子绿僵菌( M． anisopliae) Ma09 和黄绿绿僵菌( M． flavoviride) FI985，均由广东省林业科学研究院提供。

　　1． 2 土壤非目标真菌的分离与鉴定

　　土壤采集于广东省内的苗圃地、桉树林地和松树林地，独立保存带回实验室进行分离。在无菌条件下，取5 g 土样置于容量为100 mL 三角瓶内，加入0． 3%吐温-80 无菌溶液50 mL，200 rpm 下振荡20 min，静置3min 后，再取上层溶液，用无菌水进行连续 4 次 10 倍梯度稀释，获得 5 个浓度的菌悬液。取不同浓度的菌悬液 100 μL 均匀涂于萨氏培养基( SDAY) 平板( 直径为 9 cm) ，在( 26 ±1) ℃下暗培养 3 ～4 d，挑取单菌落点接于无菌的 SDAY 平板进行纯化、鉴定。鉴定后转接于 SDAY 斜面培养基，保存于广东省林业科学研究院。

　　1． 3 3 种真菌抗生素对 6 种土壤非目标真菌的抑制效果测定

　　毛霉、黄曲霉、黑曲霉、青霉( Penicillium commune) 、拟青霉( Paecilomyces fumosa-roseus) 、灰霉( Botrytis ci-nerea) 在土壤内含菌量高、生长速度快，易造成绿僵菌分离时大面积污染，故选为真菌抗生素抑菌效果的测试对象。在 SDAY 培养基添加不同浓度伊曲康唑( 5，10，25，50，100，200 μg/mL) 、两性霉素( 1，5，10，50，100，200 μg / mL) 和放线菌酮( 1，5，10，20，50，100 μg / mL) ，制成抑菌培养基平板( 直径为 9 cm) 。用接种针挑取供试的 6 种真菌孢子( 菌丝) 点接于抑菌培养基平板中央，每处理 5 重复，( 26 ±1) ℃暗培养［4］。以不加真菌抗生素的 SDAY 平板作对照( CK) ，接种后第 3 天起，每 24 h 用十字交叉法测量各菌落直径，至菌落长满培养皿。计算 3 种真菌抗生素对各真菌的相对抑制率，将相对抑制率转换成几率值( Y) 、药剂浓度转换成以10 为底的对数值( lgx) ，做线性回归，得毒力回归方程( Y = algx + b) 和相关系数( Ｒ) ，计算3 种真菌抗生素对供试 6 种土壤非目标真菌生长的有效抑制浓度( EC50和 EC90) ，结合相对抑制率评价真菌抗生素对 6 种非目标真菌抑制作用的强弱。

    相对抑制率 A = ( B － C) /B ×100%

    式中，B 为对照组菌落平均直径( mm) ，C 为处理组菌落平均直径( mm) 。

　　1． 4 3 种真菌抗生素对绿僵菌生长影响测定

　　在添加终浓度为 200 μg/mL 的伊曲康唑、100 μg/mL 的两性霉素和 100 μg/mL 放线菌酮的 SDAY 培养基平板中央，分别点接金龟子绿僵菌 Ma09 和黄绿绿僵菌 FI985 孢子，每处理 5 个重复，( 26 ±1) ℃暗培养，以不加真菌抗生素的 SDAY 培养基作对照，接种后采用十字交叉法每天测量绿僵菌菌落直径，按 1． 3 的方法计算相对抑制率，评价 3 种真菌抗生素对绿僵菌生长的影响。

　　1． 5 数据处理

　　应用 DPS 和 Excel 软件进行方差分析、Duncan 新复极差分析和毒力回归分析。

　　2 结果与分析

　　2． 1 真菌抗生素对供试 6 种土壤非目标真菌的抑菌效果分析

　　2． 1． 1 菌落生长趋势 不同浓度的伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮对供试的 6 种非目标真菌均有抑制作用，且真菌抗生素浓度越大菌落生长越慢。图 1 ～ 2 是以黄曲霉、青霉和黑曲霉为例，在不同浓度的伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮作用下的生长变化趋势。

　　图 3 ～4 表明，接种后第 4 天，3 种真菌抗生素对 6 种非目标真菌均有抑制作用，同种抗生素对真菌的相对抑制率随药剂浓度的增加而提高。不同真菌抗生素对供试菌的抑菌效果差异明显，伊曲康唑对黑曲霉和毛霉的抑制效果较差，在浓度为 100 μg/mL 时对其它 4 种真菌均有较好的抑制效果; 两性霉素对 6 种真菌的抑制效果较一致，对黄曲霉最佳，在浓度为 100μg /mL 时即可完全抑制其生长; 放线菌酮对灰霉和拟青霉有较好抑制效果，在浓度为 50 μg/mL 时即可完全抑制灰霉的生长。

　　2． 1． 2 相对抑制率分析 伊曲康唑在测试浓度范围内均不能完全抑制供试菌的生长，对黄曲霉和青霉的抑制率要高于其他几种供试菌，对青霉的抑制率平均超过 70%; 对黄曲霉的抑制率，除了 5 μg/mL 浓度外，其他浓度达到 70%以上( 表 1) 。对毛霉和黑曲霉的抑制效果最差，对毛霉最高抑制率为 54． 84%。

　　两性霉素浓度为 100 μg/mL 及以上可完全抑制黄曲霉的生长; 浓度为 25 μg/mL 时，对黑曲霉和灰霉抑制率分别为 70． 09%和 73． 73%。两性霉素对毛霉的抑菌效果比伊曲康唑好，当浓度为 100 μg/mL 时，抑制率为 74． 77%; 当浓度为 200 μg/mL 时对 6 种供试真菌的相对抑制率达到 76%以上。

　　放线菌酮对灰霉抑菌效果较好，浓度为50 μg / mL 时即可完全抑制灰霉的生长，1μg /mL 也可达到 61． 9% 的抑制率。当浓度达到 50 μg/mL 时对黄曲霉和毛霉的抑制率达到 90%以上，对于拟青霉和青霉也达 70%以上。当浓度为 100 μg/mL 时，对于 6 种供试菌抑菌率均达到 75% 以上，其中毛霉、拟青霉和灰霉均为 100%。

　　2． 1． 3 毒力回归分析 3 种抑菌剂对 6 种真菌的毒力回归分析表明，各回归方程均能较好的拟合( Ｒ ＞ 0． 84) ( 表 2) 。抑制浓度( EC50，EC90) 分析表明，3 种真菌抗生素对供试 6 种真菌的抑制效果差异明显。伊曲康唑对青霉、拟青霉、灰霉、黑曲霉和黄曲霉有较好的抑制效果，EC50分别为 0． 54，3． 33，3． 96，3． 97，6． 93 μg/mL; 对毛霉的抑制效果较差，EC50达 90． 57 μg/mL。两性霉素对毛霉的抑制效果比较差，对灰霉抑制效果最好，EC50仅为 3． 23 μg/mL，对另外 4 种真菌的EC50为 9． 48 ～16． 59 μg/mL。放线菌酮对灰霉抑制效果最好，EC50为6． 87 μg/mL，而对于其他5 种真菌抑制效果相当，EC50为 13． 82 ～27． 43 μg/mL。两性霉素和放线菌酮浓度分别为 35． 28，27． 43 μg/mL 时即对 6 种真菌可达到 50%的相对抑制率。伊曲康唑作用于毛霉和两性霉素作用于黑曲霉的 EC90都极大，表明 2 种真菌抗生素无论浓度多大，对供试菌都不能百分百抑制。

　　2． 2 3 种真菌抗生素对绿僵菌生长的影响

　　接种后第 3，4，5 天，3 种真菌抗生素作用下 2 株绿僵菌菌落直径间均差异极显着( P ＜0． 01) ( 表 3) 。其中放线菌酮作用下的菌落直径与对照差异不显着; 两性霉素作用下除了第 4 天 FI985 菌株的菌落直径与对照差异不显着，其他处理均显着小于对照; 伊曲康唑作用下 2 株绿僵菌接种第 3，4，5 天的菌落直径均显着小于对照，结果表明伊曲康唑和两性霉素对绿僵菌具有一定的抑制作用，且伊曲康唑大于两性霉素，放线菌酮对绿僵菌的抑制作用不明显。

　　3 结论与讨论

　　综合伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮对灰霉、拟青霉、黄曲霉、黑曲霉、毛霉、青霉的生长抑制效果分析，两性霉素和放线菌酮均能有效控制 6 种非目标真菌的污染，抑制效果比伊曲康唑好，且以放线菌酮为最优。

　　伊曲康唑对绿僵菌菌落生长的影响显着大于两性霉素和放线菌酮; 放线菌酮作用下的绿僵菌菌落直径与对照间差异不显着，当浓度为 27． 43 μg/mL 时对 6 种供试非目标真菌的抑制率即达 50%，浓度为 50 μg/mL时即可抑制绝大部分真菌生长，满足绿僵菌分离的要求，是绿僵菌分离的首选真菌抗生素，其次是两性霉素。

　　伊曲康唑和两性霉素对绿僵菌有一定的抑制作用，但都不会完全抑制绿僵菌生长，因此可以根据研究目的选择性使用。在进行绿僵菌土壤宿存动态研究时应选择对绿僵菌生长影响小的抗生素，以免影响绿僵菌在土壤内的实际数量，而在进行土壤内绿僵菌菌株分离收集时，可根据土壤内杂菌的类型和数量，适量添加相应的抗生素，以减少污染。

　　参考文献

　　［1］ 彭立群，田子珩，张俊琦． 植物组培中污染发生原因及防治技术研究进展［J］． 广东林业科技，2012，28( 1) : 82-86．

　　［2］ 包建中，古德祥． 中国生物防治［M］． 太原: 山西科学技术出版社，1997．

　　［3］ 刘萍萍，闫艳春． 微生物农药研究进展［J］． 山东农业科学，2005，7( 2) : 78-80．

　　［4］ 李德新，郭凤根，王仕玉，等． 3 种抑菌剂对蛇足石杉内生真菌黑曲霉的抑制效果研究［J］． 安徽农业科学，2011，39( 20) : 12106-12107，12110．