具有一轮感染力的伪型埃博拉病毒的构建

　　埃博拉出血热自1976年在非洲扎伊尔首次爆发以来，已经在非洲引起多次暴发。其中以2014年在非洲中部国家发生最为严重，共造成10000多人死亡，引起各国科学家的广泛关注[1].

　　埃博拉病毒（Ebolavirus,EBOV）属于丝状病毒科，其基因组为单股负链RNA,该病毒可以引起高度接触性出血热症状，致死率可达90%,为病死率最高的传染病病原之一[2-3].EBOV共分为5个亚型，即扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、本迪步焦型和科特迪瓦型[4-5].病毒的基因组编码7种蛋白，依次为NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24和L.其中GP在翻译后水解为GP1、GP2两种形式[6-8].病毒通过其GP与靶细胞表面的受体结合，而启动感染过程[9].目前对EBOV病仍没有有效的疫苗防制方法，由于该病毒的活毒操作需要在生物安全4级实验室进行，因此有必要建立一个能够替代活病毒操作的、安全方便的病毒研究平台。

　　伪病毒是人为构建的一种外表面由靶病毒的囊膜蛋白作为外壳，而内部骨架却是由另一种病毒的核酸及蛋白组成的病毒颗粒[10-11].这种病毒表面缺少自身囊膜蛋白，基因组上也没有编码囊膜蛋白的基因，因此只能进行单轮感染，属于复制缺陷型病毒。由于表面包裹的是靶病毒的囊膜，因此可以模拟真病毒研究病毒的侵入机制，尤其适用于在常规条件下对高度危险性病原的研究。本研究通过将含有GP基因的重组质粒与囊膜蛋白缺失、表达绿色荧光蛋白（GFP）的人免疫缺陷病病毒1型（HIV-1）基因组的重组质粒共转染293T细胞，构建了具有一轮感染力的伪型EBOV,为后续研究EBOV的感染机制及中和抗体的筛选提供了一个良好的平台。

　　1材料和方法

　　1.1主要实验材料表达GFP蛋白及表面囊膜蛋白基因缺失的HIV-1基因组的重组质粒pNL-△Env-GFP、293T、Vero、人宫颈癌细胞（Hela）、人骨肉瘤细胞（Ghost）细胞系均由本实验室保存；与Flag标签融合表达的EBOV囊膜蛋白GP基因的重组质粒pcDNA-EboVGP由密苏里大学分子微生物与免疫学系LiuShan-lu教授馈赠；聚乙烯亚胺（PEI）购自Polysciences公司；鼠源抗Flag标签抗体和兔源抗GP的单克隆抗体（MAb）购自Sino Biological公司；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG（IgG-HRP）购自Jackson公司；ECL底物显色液购自Thermo公司；1.2EBOVGP蛋白的表达鉴定将0.5×106个293T细胞铺于6孔板，37℃5%CO2中培养24h后，将2μgpcDNA-EboVGP与6μLPEI转染细胞，4h更换含有10%胎牛血清、1%青霉素及1%链霉素的培养液。以质粒pcDNA3.1为空白对照，转染后48h收集细胞，经PBS洗涤，RIPA冰浴裂解10min.

　　利用SDS-PAGE检测后，转印NC膜，分别以鼠源Flag抗体和兔源Ebov-GP抗体为一抗，分别以羊抗鼠和羊抗兔IgG-HRP为二抗，ECL孵育，胶片曝光，进行westernblot鉴定。

　　1.3伪型EBOV的组装及检测将3.5×106个293T细胞铺于100mm的细胞培皿中，将10μgpcDNA-EboVGP、10μgpNL-△Env-GFP与30μLPEI按上述转染方法进行共转染。同时以转染10μgpNL-△Env-GFP与20μLPEI为对照。48h后收集细胞培养上清，3000r/min低速离心10min后25000r/min超速离心2h,弃上清，90μLRIPA重悬管底沉淀，按照上述方法进行westernblot检测，并以HIV基质蛋白（p24）及β-actin蛋白作为检测内参。

　　1.4伪型EBOV的感染采用制备的伪病毒粒子分别感染单层的Vero、293T、Ghost、Hela细胞。

　　于感染后48h通过荧光显微镜观察报告基因GFP的表达，同时收集病毒感染后的细胞，流式细胞仪分析假病毒感染细胞的情况，计算GFP阳性细胞比率（GFP阳性细胞比例间接反映了伪型病毒粒子对细胞的感染水平），以确定伪病毒在各种细胞中的感染力。

　　2结果

　　2.1EBOVGP蛋白表达的鉴定将重组质粒pcD-NA-EboVGP和pcDNA3.1空白对照质粒分别转染293T细胞后，48h后收集细胞进行蛋白裂解。

　　Westernblot试验显示，利用鼠源Flag标签抗体及兔源抗EBOVGP蛋白特异性抗体均能够检测到GP蛋白的表达，而空白对照组未检测到蛋白表达（图1）。

　　表明GP蛋白可以正确的表达。

　　2.2伪型EBOV的组装将重组质粒pcDNA-EboVGP和pNL-△Env-GFP重组质粒共转染293T细胞，48h之后收集转染细胞上清。Westernblot结果显示，pNL-△Env-GFP质粒转染细胞以后，HIV基质蛋白p24能够表达，表明病毒的基因组能够提供伪型病毒包装所需的相关组分。对超速离心纯化的伪型病毒粒子进一步进行westernblot检测，结果表明HIVp24蛋白与GP蛋白能够同时被检测到，而阴性对照组仅能够检测到p24蛋白（图2），表明GP蛋白与HIV基因组及相关蛋白进行了有效组装。

　　2.3伪型EBOV的感染试验收集转染后含有伪病毒的上清液分别感染Ghost、Hela、Vero、293T细胞系，结果显示感染48h后在几种细胞系中均可检测到报告基因GFP的表达（图3A）；为确定病毒对不同细胞的感染效率差异，收集感染后的细胞，通过流式细胞仪进行检测，计算GFP阳性细胞比率。结果表明，构建的伪病毒能够感染6种细胞，其中对Ghost、Vero的感染效率较高，但对Hela、293T细胞感染效率较低（图3B），表明Ghost、Vero两种细胞更适合于伪型病毒的特性研究。

　　3讨论

　　生物安全是公共安全领域优先发展领域中的重要内容之一，而EBOV具有极强的接触传染性，必须在生物安全4级实验室完成对该病毒的实验操作，为研究带来了诸多不便。由于伪型病毒是复制缺陷型，只具有一轮感染力，因此为病毒的研究提供了一种安全、有效的技术手段。近来，伪型病毒的构建和应用为研究高致病性病毒的囊膜蛋白的结构和功能提供了良好的平台。目前应用的假病毒核心主要是以HIV-1为基础的慢病毒和以VSV、MM-LV病毒为基础的逆转录病毒[12].本研究是通过构建表达EBOV囊膜蛋白基因的重组质粒，与囊膜蛋白缺失、表达有绿色荧光GFP蛋白的HIV-1基因组的重组质粒共转染293T细胞，结果表明，两种质粒所携带蛋白的基因均可以在293T细胞中正确表达，并且表达后可以进行组装获得伪病毒粒子，以此模拟活病毒进行细胞的感染试验，从而可以更加方便安全地研究EBOV的病原学、致病机理及免疫学等相关工作，为攻克EBOV准备理论基础。

　　目前携带有荧光素酶或者GFP报告基因的假病毒具有很广泛的应用，如SARS-CoV[13]、H5N1高致病性禽流感病毒、丙型肝炎病毒等均有过报道，本研究中利用带有GFP作为报告基因的HIV慢病毒系统，获得了具有感染力的EBOVGP蛋白伪型病毒。

　　GP蛋白是诱导EBOV中和抗体的关键蛋白，与病毒的入侵、细胞毒性等均起着关键作用，本研究构建的伪型病毒为病毒特异性中和抗体的筛选及蛋白功能的研究奠定了基础。