探讨ET-1能否引起大鼠心肌自由基含量的增高

　　内皮素－1(endothelin－1，ET－1)是心血管系统中ET的主要形式，可由内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、肝细胞和星形胶质细胞等合成。ET－1在心律失常、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化等多种心血管疾病发病中都起着重要作用。氧自由基是机体内氧分子的不完全代谢产物，在缺血、缺氧等应激刺激下，可导致氧自由基生成过多或清除能力减弱，体内积累过多的氧自由基可对体内大分子物质产生毒害，直接或间接导致心血管疾病的发生。此前我们已报道超氧化物歧化酶(superoxidedismutase－1，SOD－1)能明显减轻ET－1引起大鼠心律失常，本实验应用电子自旋共振(ESR)方法经大鼠检测冠状动脉口注射外源性ET－1后对大鼠心肌氧自由基含量的影响，以明确ET－1能否引起大鼠心肌自由基含量的增高。

　　1、材料与方法

　　1．1实验材料

　　1．1．1动物Sprague－Dawley大鼠30只，雄性，体重(200±20)g，由北京大学医学部实验动物中心提供。

　　1．1．2仪器E－200电子自旋共振仪(X波段，德国Brucker公司)。

　　1．1．3试剂ET－1(日本大阪肽研究所公司);超氧化物歧化酶(SOD－1，南京建成生物公司)。

　　1．2实验方法

　　1．2．1分组30只雄性SD大鼠，随机分为3组，每组10只。ET－1组:冠状动脉口注射1．5μmol·L－1的ET－1900pmol·kg－1;SOD－1+ET－1组:冠状动脉口注射SOD－10．6mg·kg－14min后，再注射1．5μmol·L－1的ET－1900pmol·kg－1(各组大鼠ET－1的注射剂量均为0．6mL·kg－1);对照组:冠状动脉口注射生理盐水0．6mL·kg－1。

　　1．2．2冠状动脉口注射［6］大鼠用20%尿酯6mL·kg－1腹腔注射麻醉，仰卧位固定，气管插管，分离右侧颈总动脉。然后经右颈总动脉插管，管尖端开口达冠状动脉口，术后作冠状动脉口定位，插管末端距冠状动脉口0．5mm为正确位置，沿此管注射药物，见图1。

　　1．2．3心肌标本冠状动脉口注射ET－110min后立即开胸取左心室心肌约300mg剪成细条，装入内径4mm的塑料管中，填长3cm放置液氮在10min内ESR检测。自心肌取材至放入液氮冻藏时间平均为15s。

　　1．2．4ESR测试ESR用E－200波谱仪测试。

　　先将样品放入谐振腔，温度调至100K，待温度平衡后记录ESR波谱。测试条件:X－波段，微波功率分别为5、10、20mW，微波频率9.172GHz，100kHz高频调制，调制幅度2．5G，滤波时间常数0．128s，扫场宽度500G。各信号峰g值计算:g=νh/βH=0．714484×ν/H(ν:微波频率;h:普朗图常数;H:磁场强度;β:玻尔磁子)。

　　1．2．5ESR谱分析采用两种方法，一是取各组O峰绝对幅度作比较，二是取各组O/S比值，O、S波均取波峰至后波谷绝对幅度表示。

　　1．3统计学方法

　　用SPSS11．0统计软件进行分析。实验数据均以(x珋±s)表示，数据处理采用组间单因素方差分析法比较，P≤0．05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　2．1各组大鼠心肌ESR波谱各组ESR波谱

　　自左向右主要由O、S、T三个波峰组成，经计算其中S峰g值为2．008，T峰g值为1．937，分别与半醌自由基及过渡金属离子的g值相近。因此，S峰可认为是半醌自由基信号，T峰为过渡金属离子信号，O峰g值为2．024与氧中心自由基g值相似，O峰为氧自由基信号，见图2。各组测量值见表1。从表中可看出，①O峰:ET－1组心肌氧自由基O峰明显高于对照组及SOD－1+ET－1组(P＜0．05)，而SOD－1+ET－1组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);②O/S比值:ET－1组与对照组及SOD－1+ET－1组相比，差异有统计学意义(P＜0．05)。表明冠状动脉口注射ET－1后，大鼠心肌氧自由基含量明显增多，提示有激发自由基释放作用，同时也进一步证明SOD－1具有清除氧自由基的作用。

　　2．2ET－1组大鼠心肌在不同微波

　　频率下的ESR波谱改变微波功率对O峰和S峰幅度的影响结果见图3。O峰的饱和功率远大于S峰的，这一现象与氧自由基ESR信号的饱和功率高和半醌自由基ESR信号饱和功率低相一致，进一步证明本实验所获及的O峰可能代表活性氧自由基。

　　3、讨论

　　自由基是指那些最外电子层具有不成对电子的分子、原子、离子和基团。自由基一般反应性较强，因而其寿命一般较短，如氧自由基。但也有少数自由基，反应性并不强，寿命也较长，在通常环境中具有一定的稳定性，如醌类自由基，这些自由基常被用做自旋标记物。氧自由基具有顺磁性和很高的反应活性，其测定方法主要有电子自旋共振法、比色法和电化学法等。

　　ESR又称电子顺磁共振(electronparamagnet-icresonance，EPR)，是研究电子自旋能级跃迁的一门学科，主要用来研究具有未成对电子结构的自由基、原子、分子(包括三线态分子)，且不会对自由基产生破坏作用，是检测顺磁性、相对稳定的自由基最直接最有效的方法。

　　本实验采用ESR方法检测了心肌自由基含量，给大鼠冠状动脉口注射ET－1后，O峰明显上升降，而相应半醌自由基的S峰基本保持不变，即代表氧自由基含量的O峰与O/S比值增大，明显高于对照组，表明ET－1有激发心肌细胞产生氧自由基作用。为了进一步证实上述实验中所得ESR波谱中相应O峰是氧自由基，我们使用了超氧阴离子特异清除剂SOD。超氧阴离子自由基在SOD的作用下生成H2O2，H2O2又在过氧化氢酶的作用下最终生成对人体无害的物质———H2O和O2，从而彻底清除超氧阴离子自由基。本实验结果表明SOD－1+ET－1组的O峰降低、O/S比值下降，均明显低于ET－1组，说明注入SOD后氧自由基成分(含量)减少。外源性ET－1可以降低SOD活性，从而导致心肌氧自由由基升高，其具体机制尚需进一步研究。

　　参考文献:
　　［1］ Yanag Sawa M，Kurihara H，Kimura S，et al． A novelpotent constrictor peptide produced by vascular endo-thelial cell ［J］． Nature，1988，322( 31) : 411 － 415．
　　［2］ 刘镇，曾纪斌，古春花，等． 高血压患者脉压差变化与 CRP、ET －1 的相关性［J］． 临床医学工程，2012，19( 8) : 1280 － 1281．
　　［3］ Ren AJ，Yan XH，Lu Hong，et al． Antagonism of in-hibits hypoxia － induced apoptosis in cardiomyocytes［J］． Can J Physiol Pharmacol，2008，86: 536 －540．
　　［4］ 蔡志福，陈铭伍，冼磊． 氧自由基与心肌保护［J］． 广西医学，2010，32( 2) : 226 －228．
　　［5］ 袁文俊，戎伟芳，严云，等． 超氧化物歧化酶拮抗内皮素所致大鼠和猫的心律失常［J］． 第二军医大学学报，1996，17( 6) : 539 －541．
　　［6］ 袁文俊，许金廉，蒋应明，等． 大鼠冠状动脉口注射定位 方 法［J］． 第 二 军 医 大 学 学 报，1995，16( 6) : 569．
　　［7］ 赵保路． 电子自旋共振技术在生物和医学中的应用［M］． 合 肥: 中 国 科 学 技 术 大 学 出 版 社，2009:21 － 25．
　　［8］ Pan YM，Zhang XP，Zhu JC，et al． Separation and ac-tivity of antioxidant components from polygonum cuspi-datum［J］． Fine Chem，2005，22( 11) : 835 － 837．
　　［9］ Guo YL，Li C，OU LC，et al． Analysis and studies onthe capability of resistance to oxidation of phyllanthusemblica L［J］． Journal Honghe University ，2004，2( 6) : 10 －14．
　　［10］ Zhao Baolu． Applications of electron spin resonance inbiology and medicine［J］． Chinese Journal of Mag-netic Resonance，2010，27( 1) : 51 － 64．
　　［11］ Ren AJ，Yuan X，Lin L，et al． Effects of endothelin －11 － 31 on cell viabililty and ［Ca2 +］( i) in culturedneonatal rat cardiomyocytes［J］． Physiol Res，2008，57: 373 － 378．