动脉粥样硬化（ＡＳ）是一种累及全身血管的慢 性病变。ＡＳ不仅仅是脂质代谢紊乱，同时也是一种慢性炎症性疾病，多种免疫细胞及细胞因子参与了其发生与进展。单核细胞迁移到内皮下转化为具有吞噬作用的巨噬细胞，通过清道夫受体（ｓｃａｖ－ｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＳＲ）吞噬脂质形成泡沫细胞，释放一系列炎性因子及趋化蛋白，启动炎症级联反应，促进ＡＳ进展。此外，泡沫细胞沉积于内皮下，导致内膜进一步改变。白细胞介素（ＩＬ）被认为是调节ＡＳ进展中泡沫细胞形成的关键因素。
ＩＬ－３７能够抑制多种炎性因子的表达，平衡体内促炎因子与抑炎因子，抑制树突状细胞的活化，减轻炎症 反应。有实验在ＡＳ组织泡沫细胞中检测到ＩＬ－３７蛋白表达，但其能否影响单核巨噬细胞的泡沫化尚未明确。本研究以人单核细胞系ＴＨＰ－１为对象，体外模拟巨噬细胞泡沫化的过程，观察ＩＬ－３７的作用，并对可能机制进行探讨。
１材料与方法
１．１材料
ＴＨＰ－１细胞系购自美国ＡＴＣＣ公 司，ＲＰＭＩ１６４０及胎牛血清购 自Ｇｉｂｉｃ公 司，ｏｘ－ＬＤＬ购 自Ｙｉｙｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，小鼠抗人ＡＢＣＡ－１单克隆抗体（ｓｃ－５８２１９）购自美国ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ公司，β－Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８）购自美国ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ公司，兔抗人ＣＤ３６单克隆抗体购自美国ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司，小鼠 抗 人ＳＲ－Ａ单克隆抗体购自美国Ｒ＆Ｄ公 司，Ｔｒｉｚｏｌ及ＲＴ－ＰＣＲ试 剂 盒 购 自 日 本Ｔａｋａｒａ公 司，ＣＤ３６引物、ＳＲＡ引物、ＡＢＣＡ－１引物、ＧＡＰＤＨ引物由中国武汉擎科生物公司设计合成。
１．２方法
１．２．１ ＴＨＰ－１细胞培养ＴＨＰ－１细胞为悬浮生长细胞，用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养基，培养基加入青霉素（１００Ｕ／ｍｌ）和链霉素（１００μｇ／ｍｌ），３７℃、５％ ＣＯ２培养箱中静置培养，每２～３ｄ传代１次。
１．２．２巨噬细胞的分化１ ０００×ｇ、５ｍｉｎ离心上述培养的ＴＨＰ－１细胞，弃上清，按１×１０６／ｍｌ重悬于新的培养基中，接种到６孔板或者细胞培养瓶中，加入ＰＭＡ（终浓度为１６０ｎｍｏｌ／Ｌ），３７℃、５％ＣＯ２培养箱中静置培养２４ｈ，观察细胞贴壁和形态改变。
１．２．３分组及建立泡沫细胞模型ＴＨＰ－１细胞（１×１０６／ｍｌ）在１６０ｎｍｏｌ／Ｌ ＰＭＡ刺激２４ｈ分化为巨噬细胞，然后分别给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（５ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（２０ｎｇ／ｍｌ）。各组细胞均置５％ ＣＯ２、３７℃孵箱，培养２４ｈ。其中仅给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）单独刺激的对照组再进行进一步分组实验，一组给予ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ），另一组仅更换新鲜培养基，２４ｈ后收集细胞。
１．２．４油红Ｏ染色观察泡沫细胞形态将ＴＨＰ－１培养于放有盖玻片的６孔培养板内，用ＰＭＡ刺激２４ｈ后，加入ｏｘ－ＬＤＬ和（或）ＩＬ－３７干预２４ｈ。待处理结束后，弃上清，用预冷ＰＢＳ液冲洗３次。４％多聚甲醛固定２～４ｍｉｎ，０．３％油红Ｏ染色液染色１５～２０ｍｉｎ，苏木素染色５ｍｉｎ，盐酸酒精分色，明胶甘油封片，显微镜观察。收集图像并用图像分析系统分析。
１．２．５细胞内脂质测定弃干预后的细胞培养液，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，冰浴３０ｍｉｎ，用细胞刮刮下细胞，８００×ｇ离心１０ｍｉｎ，加入０．５ｍｌ的氯仿－甲醇（２∶１）混合液研磨，３ ０００×ｇ、４℃离心３０ｍｉｎ，取上清液，加两倍体积的冰生理盐水，３ ０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，去除上层液体，将下层有机相转移到干燥的ＥＰ管，用ＴＣ试 剂 盒 测 定ＴＣ，沉 淀 用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ ０．２ｍｌ溶解，ＢＣＡ法测细胞内蛋白质含量。细胞内胆固醇含量用每克蛋白所含的ＴＣ表示。
１．２．６ ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＮＡ提取上述干预后的细胞，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，每孔加入１ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ，静置１０ ｍｉｎ，用枪吹打 数次，吸入无ＲＮＡ酶 的１．５ｍｌ ＥＰ管中，每管加入２００μｌ氯仿，震荡数秒，室温静置１０ｍｉｎ，１２ ０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃，离心；吸取上层液体层２００～３００μｌ到另一ＥＰ管中，等体积加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，－２０℃，放置１０ｍｉｎ，１２ ０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃离心；弃上清，加入１ｍｌ预冷无水乙醇，７ ５００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，离心；尽最大可能将上清丢弃，加入２０μｌ的ＤＥＰＣＨ２Ｏ。
ＲＮＡ浓度和纯度测定取１μｌ所提取的ＤＮＡ溶液加入９９μｌ ＤＥＰＣ水，充分混匀，然后用核酸分析仪检测Ａ２６０，Ａ２６０／Ａ２８０比值，ＲＮＡ浓度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×１００×稀释倍数，Ａ２６０／Ａ２８０比值在１．８～２．０纯度较高。逆转录温度梯度ＰＣＲ仪按３７℃１５ｍｉｎ、８５℃５ｓ、４℃的程序进行逆转录。
ＰＣＲ引物序列 引 物 序 列 如 下：
ＧＡＰＤＨ：５′－ＣＣＡＣＣＣＡＴＧ－ＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ －３′，５′－ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ－３′；ＣＤ３６：５′－ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＴ－ＧＧＧＧＣＴＡＴ－３′，５′－ＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧ－Ｇ－３′；ＳＲ－Ａ：５′－ＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡ－３′，５′－ＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＣ－３′；ＡＢＣＡ１：５′－ＴＧＴ－ＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧ －Ｔ３′，５′－ＡＡＧＣＧＡ－ＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＴＴ －３′。
ＲＴ－ＰＣＲ按Ｔａｋａｒａ公司ＰＣＲ试剂盒说明，按ＲＯＸ ０．２μｌ，ＳＹＢＲ?Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑＴＭ ＩＩ ５μｌ，ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ０．２μｌ，ＰＣＲ Ｒｅ－ｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ０．２μｌ，ＤＮＡ模板１μｌ，ｄＨ２Ｏ ３．４μｌ，配制１０μｌ扩增体系；采取两步法ＰＣＲ扩增标准程序：９５℃、３０ｓ，９５℃、５ｓ，６０℃退火、延伸３０ｓ，共４０个循环。
１．２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测蛋白质提取上述干预后的细胞，预冷ＰＢＳ冲洗３次，细胞刮用力将细胞刮落，用１ｍｌ ＰＢＳ重悬于１．５ｍｌ ＥＰ管中，３ ０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃离心，弃上清，加入现配的与沉淀体积约等的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂复合物，将沉淀吹散，冰浴３０ｍｉｎ，３０ｓ、６次涡旋，间隔５ｍｉｎ进行１次；１２ ０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，离心；吸取上清为细胞蛋白质。蛋白浓度测定和变性按照ＢＣＡ蛋白测定试剂盒的说明，用酶标仪检测样本的蛋白浓度。而后按每个样本上样６０μｇ分装样本到２００μｌ的ＥＰ管中，９５℃、１０ ｍｉｎ，使蛋白变性。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ电泳按浓缩胶６０～８０Ｖ恒压，分离胶１００～１５０Ｖ恒压，到蛋白Ｍａｒｋｅｒ条带区分明显或者溴酚蓝到达分离胶最低端；转膜用３００ｍＡ恒流，根据目标蛋白分子量大小决定转膜时间；５％脱脂奶粉封闭３ｈ，ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，一抗按说明书要求稀释，摇床冰浴过夜；ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，二抗按１∶３ ０００稀释，封闭２ｈ；ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，用Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ成像系统检测并收集图像。
１．３统计学处理
实验均重复３次，实验数据以珚ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１２．０作统计学处理。组间数据处理根据方差齐性分析的结果，进一步使用ＳＮＫ检验，进行组间差异的比较，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１泡沫细胞形态及细胞内脂质测定光固定和油红Ｏ染色光镜下显示，ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ组细胞摄取ｏｘ－ＬＤＬ减少，胞内脂质小滴显着减少，油红Ｏ染色阳性细胞较ｏｘ－ＬＤＬ组显着减少，且细胞形态多改变较 少 （图１）。ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ组巨噬细胞内ＴＣ水平较ｏｘ－ＬＤＬ组显着减少［（１５０．４±７．３６）ｎｇ／ｍｇ∶（３０３．１±８．９）ｎｇ／ｍｇ，Ｐ＜０．０１］。
２．２ ＴＨＰ－１源巨噬细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表达水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组ＴＨＰ－１源巨噬细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表达水平见表１，不同浓度ｏｘ－ＬＤＬ组表达水平见表２。
２．３泡沫细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表达水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）组 泡 沫 细 胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表达水平见表３。
３讨论
ＡＳ是是一种多因素参与的病理过程。脂质代谢紊乱和炎症反应是致ＡＳ的最主要的两个原因，彼此相互促进，加速ＡＳ的进展。血液中的单核细胞迁移进入内皮下分化为巨噬细胞，通过ＳＲ吞噬血管内膜下聚集的脂质尤其是ｏｘ－ＬＤＬ形成泡沫膜细胞，启动ＡＳ的进程。泡沫细胞聚集形成斑块是ＡＳ的主要病变特征，同时泡沫细胞的形成启动了动脉内皮下慢性炎症级联反应，促进病变的进展。
研究表明，多种细胞因子在ＡＳ泡沫细胞的形成中发挥了重要作用。这些细胞因子可以通过上调或下调巨噬细胞表面ＳＲ，调节巨噬细胞对脂质的摄取，促进或者抑制泡沫细胞的形成；也可以通过上调或下调巨噬细胞逆向脂质运输相关蛋白的表达，延缓或加速泡沫细胞的形成。巨噬细胞通过细胞表面表达的一系列ＳＲ识别、摄取内皮下脂质；同时也表达逆向胆固醇转运蛋白，处理胞内聚集的脂质；二者的失衡将影响泡沫细胞的形成。
本实验表明，ＩＬ－３７能够抑制ＴＨＰ－１源巨噬细胞摄取ｏｘ－ＬＤＬ，促进胞内脂质外流，减少泡沫细胞的形成，具有抗ＡＳ的作用。我们通过油红Ｏ染色从形态学观察到ＩＬ－３７能够减少ＴＨＰ－１源巨噬细胞形成泡沫细胞，降低ＴＨＰ－１源巨噬细胞胞内ＴＣ的聚集。与ＩＬ－１０通过多种机制减少泡沫细胞的形成，其中有些存在争议。本实验明确了ＩＬ－３７抑制泡沫细胞的机制，与ＩＬ－３３、ＴＧＦ－β相似，ＩＬ－３７通过抑制ＳＲＡ和ＣＤ３６，同时增强逆向胆固醇运输蛋白ＡＢＣＡ１的表达，减轻巨噬细胞脂质负荷，减少泡沫细胞的形成，且该作用具有浓度依赖性。此外，用ＩＬ－３７和ＰＭＡ同时刺激ＴＨＰ－１的分化，能够减少巨噬细胞的形成，并且抑制所活化的巨噬细胞形态的改变，如变形、伸出伪足的细胞明显减少，与之前的研究一致。
研究表明，ＩＬ－３７具有下调多种炎性因子的作用，减少体内树突状细胞的数量，且可以下调树突状细胞表面蛋白ＣＤ８６和ＭＨＣⅡ表达量，减轻固有免疫和适应性炎症反应。与ＩＬ－３３和ＩＬ－１α相似，ＩＬ－３７具有双重生物学活性，一方面作为可溶性细胞因子，通过与ＩＬ－１８α或者ＩＬ－１８ＢＰ结合，发挥抗炎作用，但是详细的机制尚未阐明；另一方面成熟的ＩＬ－３７作为核转录因子进入细胞核，与Ｓｍａｄ３相互作用，调节多条信号通路的关键酶，包括ＦＡＫ、ＰｙＫ２、ＭＡＰＫｐ３８、ＳＴＡＴｓ１－４等。转染ＩＬ－３７的ＴＨＰ－１细胞，受到ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ刺激后，与对 照 组 相 比，ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐ３８α、ＳＴＡＴｓ、ｐ５３、ＴＯＲ的表达显着下调［１］；其中ＳＴＡＴ是脂质代谢ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号通路的关键转录因子，通过调控ＡＢＣＡ１的表达影响吞噬细胞逆向转运胞内脂质；此外，ｍＴＯＲ信号通路、ＭＡＰＫ信号通路也参与了巨噬细胞的脂质代谢。所以，我们推测成熟的ＩＬ－３７进入细胞核后，与Ｓｍａｄ３结合，通过多条脂质代谢通路调节巨噬细胞ＳＲ和胆固醇逆向转运受体的表达，调控巨噬细胞泡沫化，从而影响ＡＳ的进程。
ＳＲ和逆向胆固醇转运蛋白是巨噬细胞泡沫化的关键因素，ＳＲＡ和ＣＤ３６是巨噬细胞结合和摄取ｏｘ－ＬＤＬ的主要受体，ＡＢＣＡ１是巨噬细胞内胆固醇外流的重要转运体。敲除ＣＤ３６基因后小鼠以及同时敲除ＣＤ３６，ＳＲＡ基因小鼠ＡＳ进程明显延缓；而上 调ＡＢＣＡ１则 能 够 延 缓ＡＳ的 进 展，表 明ＣＤ３６、ＳＲＡ和ＡＢＣＡ１起着重要的作用。本实验结果表明，ＩＬ－３７可以显着抑制ＣＤ３６和ＳＲＡ的表达，促进ＡＢＣＡ－１的表达，且有剂量依赖关系。此外，对 已 形 成 的 泡 沫 细 胞，ＩＬ－３７也 能 显 着 上 调ＡＢＣＡ１，下调ＳＲＡ和ＣＤ３６的表达。
综上所述，ＩＬ－３７具有抗ＡＳ的作用。结合之前关于ＩＬ－３７具有下调多种炎性因子、抑制炎性细胞活化、减轻炎症反应的研究，相信ＩＬ－３７有可能会成为ＡＳ预防和治疗的新靶点。
参考文献
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