水通道蛋白1和4在挫伤肺组织中的表达变化

　　肺挫伤是创伤病人中常出现的一种闭合性损伤，创伤导致的肺组织出血、水肿是急性呼吸窘迫综合征的主要危险因素，老年患者由于身体各项功能都出现衰退趋势，加上基础疾病较多，因此病情更加复杂、凶险，显著加大了救治难度〔1〕，早期采取有效措施减轻肺水肿对于改善患者预后具有重要意义〔2，3〕，研究肺挫伤水肿的机制，对于肺挫伤患者的临床治疗具有重要的指导意义。本研究检测水通道蛋白( AQP) 1 和 4 在挫伤肺组织中的表达变化，探讨肺水肿的形成机制。

　　1 材料和方法

　　1. 1 肺挫伤模型制作及分组
　　
　　健康老年雄性 SD 大鼠 100 只，体重 450 ～500 g，由昆明医科大学实验动物中心提供。肺挫伤模型采用金属球自由落体打击法制作，老年大鼠麻醉后放置于水平实验台上，180 g 重物自 1 m 高处自由落体，垂直撞击于大鼠右侧胸廓，于设定时间点麻醉后断头处死，分为四组: 假手术组，模型 1、3 和 6 h 组，每组 25 只，其中 10 只做水含量测定，10只做分子生物学检测，5 只做组织病理检测。

　　1. 2 肺组织含水量的测定
　　
　　大鼠麻醉后取肺组织，称量右肺中叶肺组织湿重，后置于 100℃ 恒温鼓风干燥箱中干燥 2 d 后称重，计为干重。根据下列公式计算肺组织水含量: ( 湿重－干重) /湿重×100%。

　　1. 3 肺组织 HE 染色
　　
　　取大鼠右肺上叶组织，4% 多聚甲醛固定后，切片，常规脱水、脱蜡，行 HE 染色。

　　1. 4 RT-PCR
　　
　　根据标准的 RNA 提取步骤提取总 RNA，使用反转录试剂盒( Promega) 进行反转录，具体操作根据说明书进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测各组 AQP1 和4 的表达，以 β-ac-tin 作为内参照，Image J 软件定量分析各电泳条带的灰度值，RT-PCR 产物以各样本目的基因与 β-actin 的灰度值进行比较，AQP1 上游引物序列: 5'-AAAGTGGCAAGGAAGGGACA-3'; 下游引物序列: 5'-GCTGTGGATGTTGGGAAAGAG-3'。AQP4 的上游引物序列: 5'-TTGGACCAATCATAGGCGC3'; 下游引物序列:5'-GGTCAATGTCGATCACATGC-3'; β-actin 上游引物序列: 5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'; 下游引物序列: 5'-CATCT-GCTGGAAGGTGGACA-3'。

　　1. 5 Western 印迹分析
　　
　　老年大鼠 100 mg 肺组织加入裂解液匀浆，冰上碾磨匀浆后，12 000 r/min 离心 10 min 取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白样品 50 μg，电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭 1 h，β-actin、AQP4 和1 抗体( 均购自美国 Santa cruz 公司) 稀释液孵育( 1 ∶200) ，4℃过夜，TBST 洗膜，5% 的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜后，按照 ECL 说明书，1 ∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像。

　　1. 6 统计学分析
　　
　　采用 SPSS17. 0 软件进行单因素方差分析及 LSD-t 检验。

　　2 结 果

　　2. 1 肺组织湿 /干重比和病理改变
　　
　　模型 1、3、6 h 组湿 /干比重( 0. 932 4±0. 079 6、1. 537 8±0. 071 3、2. 378 0±0. 071 3) 显著高于假手术组( 0. 799 1±0. 069 3) ( P＜0. 05) 。模型 3、6 h 组与模型 1 h 组有显著差异( P＜0. 05) 、挫伤后 1 h 组织肺泡腔内未出现明显水肿液，3 h 后，光镜下见挫伤肺组织间质出现明显肿胀，肺泡壁毛细血管出现明显扩张、红细胞外漏、水肿明显，肺泡腔内出现少量水肿液; 挫伤后 6 h，黏稠液体充满肺泡腔，肺泡间隔出现明显水肿，有大量炎性细胞浸润，假手术组未出现明显异常。

　　2. 2 各组肺组织 AQP1 和 4 的 mRNA 和蛋白表达量
　　
　　与假手术组相比，模型 3、6 h 组肺组织内 AQP1 和 4 mRNA 和蛋白表达明显升高( P＜0. 05) 。与模型 1 h 组比较，模型 6 h 组有显著差异( P＜0. 05) 。见图 1 和图 2，表 1。【图略.表1】

　　
　　3 讨 论

　　研究表明弥漫性肺泡损害、低氧血症、挫伤区肺组织的血水肿、通气与换气功能障碍时肺挫伤的主要病理生理机制〔4〕，其中肺水肿是导致肺通气功能障碍的主要原因，引起肺组织水肿的原因主要有两方面: 一方面，创伤直接破坏血管内皮和肺泡上皮的屏障完整性，使通透性增加〔5〕; 另一方面，肺挫伤后继发性产生的炎性介质，活性氧残基导致肺泡水的清除能力明显降低〔4〕。水代谢异常显著降低了肺组织的顺应性和氧合功能，是影响患者预后的重要因素。

　　研究证实 AQP 在肺挫伤后组织水肿形成中发挥重要作用，其中，AQP1 在肺挫伤后组织中的表达量明显升高〔6〕，Verk-man 等〔7〕在敲除 AQP1 基因的研究发现，AQP1 参与渗透压驱动的肺内水运动，能够促进肺水肿的形成; 袁军等〔6〕在大鼠肺挫伤模型中研究发现 AQP1 的表达在肺挫伤后明显升高，可能是肺水肿的重要参与者。AQP4 蛋白最初在 1994 年从大鼠的肺组织中克隆出来的一种选择性水转运体，属于汞不敏感性AQP 家族〔8〕，采用电镜和免疫细胞化学技术检测发现 AQP4 定位于肺组织的气管、支气管上皮及成纤维细胞的膜基质侧顶部，此外 AQP4 也存在于气管、支气管的柱状上皮的基质侧，AQP4 在肺泡水的转运及气道表面液体的调整中发挥重要作用。Verkman 等〔7〕证实发现 AQP1 缺失可导致肺泡毛细血管间的水通透性下降 10 倍，AQP1 和 4 均敲除小鼠水通透性降低 14 ～16 倍。研究采用血管外肺水( EVLW) 技术发现，AQP4的主要作用是保持肺泡相对干燥，在正常状态下表达较少，血管外肺水量的增加可以显著诱导 AQP4 蛋白表达，以纠正“渗出-吸收”的失衡〔7，9〕。朱丽华等〔10〕在大鼠油酸性急性肺损伤模型中发现，AQP4 在油酸导致损伤的肺组织中表达明显升高，这与本实验的研究结果具有一致性，同时还证明早期使用肾上腺能 β2 受体激动剂特布他林可以上调肺泡Ⅱ型细胞 AQP4 表达，明显减少肺泡腔渗出，减轻肺损伤，显著减少细胞外肺水的含量，提示 AQP4 在肺泡水肿中可以加强水转运发挥重要的抗水肿作用; 推测肺挫伤后 AQP4 表达升高，是一种肺挫伤后的代偿性升高，可能利于减轻肺泡腔水肿。以往研究证实 AQP1在肺挫伤后表达也明显升高，本研究结果与前期研究具有一致性〔11，12〕，AQP1 蛋白的表达增加则可以加重肺水肿，因此调节二者比值的平衡可能对于肺水肿早期的治疗具有重要意义，未来还需要进一步使用敲除 AQP4 或 1 基因及两者同时敲除的基因验证二者在肺挫伤中肺水肿的作用。

　　参考文献
　　
　　1 李景华 . 老年人严重肺挫伤的治疗体会〔J〕． 现代诊断与治疗，2012; 23( 5) : 508-9.
　　2 罗玉龙，李超峰，苏鹏霄 . 严重肺挫伤 150 例诊治体会〔J〕． 吉林医学，2009; 30( 19) : 2244-6.