情志病证动物实验技术研究

　　动物实验论文（8篇期刊范文）之第五篇

　　摘要：随着人们生活节奏不断加快, 不良情志刺激日益威胁人们健康, 情志病证的研究已逐渐成为热点。在情志病证的研究中, 动物实验开展较多, 实验技术则至关重要。现就情志病证动物实验相关技术作一浅析, 以期对现代情志病证的研究有所裨益。

　　关键词：情志病证,实验技术,动物实验

　　情志病证[1]是以情志刺激为主要病因或诱因而发生的疾病, 发病后有明显的情志症状的病症, 也包括由脏腑功能失调引起的表现出异常情志反应的疾病。随着现代社会的不断发展, 情志病症越来越引起人们重视。动物实验是研究疾病发生机制和评价药物效应的有力工具, 而动物实验所用到的实验技术则成为科研中必要且重要的关键所在。笔者通过检索国内外文献, 结合前期工作经验, 并不断摸索改进, 形成了较为成熟的情志病证动物实验技术。现就几种较为常用的情志病证动物实验技术进行梳理, 以期对现代情志病证动物实验的开展提供技术支持。

　　需特别指出的是, 所有实验动物均为大鼠, 所有实验步骤均遵守国际关于实验动物的伦理道德标准要求[2]。

　　1 取材

　　现代医学认为“脑”属于神经系统, 脑功能紊乱外在反应为情绪异常, 并随之导致植物神经功能系统异常。情绪与大脑的学习和记忆、语言和思维等活动均属于脑的高级整合功能, 故情志病证动物实验研究的原材料则主要为脑组织和血, 故取材技术主要为取全脑、取脑区和取血技术。

　　1.1 取全脑

　　该项技术的成熟是在国内外[3,4]研究的基础上结合笔者所在团队的不断改进, 探索出适于情志病证的取材技术。

　　(1) 麻醉:2%戊巴比妥钠 (50 mg/kg) 腹腔注射,(2) 固定:仰卧位,(3) 心脏灌流:剪开腹腔、横膈膜, 弧形向上剪开胸腔, 充分暴露心脏。将灌流针头尖端磨平[5], 从左心尖向大鼠右上45°进针至主动脉根部, 用动脉夹固定针头防止灌注针松脱, 随即剪开右心耳, 注射器抽取生理盐水经灌注针快速灌流至全身, 直至右心耳流出澄清液体, 约200 m L。改为灌注4%多聚甲醛, 先快后慢[6], 可见尾巴翘起和四肢颤动等末梢神经刺激反应, 直至全身僵直, 约200 m L,(4) 取全脑灌流结束后, 迅速断头剥脑壳, 小心取出全脑,(5) 存放放在预先存有4%多聚甲醛的离心管中, 于4℃冰箱进行后固定2~4 h。随后依次移入10%、20%、30%蔗糖溶液中行梯度脱水, 蔗糖溶液的体积约为脑组织的5倍[4];更换标准:脑组织完全沉降到管底;30%蔗糖溶液4℃可保存脑组织约3~6个月。

　　1.2 取脑区

　　(1) 麻醉、断头:2%戊巴比妥钠 (50 mg/kg) [7]腹腔注射, 快速断头,(2) 剥脑壳:在冰上快速、精准的进行, 沿矢状线剪开, 暴露颅骨, 在两眼连线与矢状线的交点处用小剪刀插入颅骨, 撬开脑壳, 迅速剥离硬脑膜, 取出全脑, 用预冷的生理盐水冲洗多余的血液,(3) 取脑区根据《大鼠脑立体定位图谱》用小弯镊在冰上快速分离出所需脑区[8,9], 放入预冷的EP管中, 液氮速冻, -80℃储存备用。

　　1.3 取血

　　取血技术主要有断头取血和腹腔取血二种方法。研究[10]表明不同的取血方法对大鼠的生化指标会产生明显的影响。断头取血多为动/静脉混合血, 亦可混入组织液、动物毛发等, 易发生溶血致检测值升高[11];且断头取血可引起应激反应, 过强的应激反应会引起机体一系列指标的变化, 甚至可能会对研究结果产生背景性干扰[12,13];此外, 应激还会引起神经内分泌系统紊乱。而情志病证的研究与神经内分泌系统息息相关, 故应采用腹腔取血技术。

　　(1) 麻醉:2%戊巴比妥钠 (50 mg/kg体质量) 腹腔注射,(2) 暴露腹主动脉:剪开腹腔, 充分暴露腹主动脉,(3) 取血:在腹主动脉的分叉处, 将注射器针头的楔面朝向下插入腹主动脉, 可看到血液自动流入注射器内, 之后抽取适量的血液,(4) 离心:移入一次性试管中, 静置30 min, 3 500 r/min离心15 min, 取上清于EP管中, -80℃储存备用。

　　2 组织形态学技术

　　对情志病证动物实验研究过程中所获得的全脑组织材料进行组织切片并染色从而在显微镜下进行形态学观察。

　　2.1 组织切片

　　组织切片是指利用切片机将动、植物组织器官切成薄片并加以染色在显微镜下进行观察的技术。用以研究器官组织、细胞的微细结构, 并可长期保存。在医学、生物学、组织胚胎学等领域应用广泛。因支持剂不同可分为石蜡切片、冰冻切片等。脑组织本身比较柔软、含水量大;冰冻切片能较完好地保存细胞在固定状态的酶和抗原活性。故其[14]在情志病证研究中最为常用, 特在此具体介绍。

　　(1) 预处理:将脑组织从蔗糖溶液中取出, 用PBS冲洗后吸水纸拭干[15], 放入冰冻切片机中冰冻5 min,(2) 包埋:以OCT或办公用胶水[16]打底, 脑组织固定于切片机探头上, 行半包埋处理,(3) 切片:于-20℃[17]环境下作连续冠状冰冻切片, 每隔3张取1张切片组成1套, 每套切片约5张, 每片厚26μm, 采用冰冻保存液收片保存于-20℃。

　　2.2 组织切片染色

　　2.2.1 HE染色:

　　在组织形态学方面, HE染色是一项基本技术, 观察直观、操作简便易于掌握、可重复性高且经济省时[18]。采用冰冻切片法[19,20]制备切片, 贴于多聚赖氨酸包被过的载玻片上, 晾干备用。

　　冰冻切片HE染色[21,22]:苏木素5 min→自来水30 s→1%盐酸乙醇10 s→自来水5 min→伊红5 s→自来水5 s→80%乙醇5 s→95%乙醇5 s→无水乙醇Ⅰ5 s→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min→中性树胶封片

　　2.2.2 免疫荧光双标技术:

　　冰冻切片免疫荧光染色具有操作快、步骤简单、组织抗原保存良好、特异性强、敏感度高等特点[23], 故多选用冰冻切片。免疫荧光技术有贴片法[24]和漂片法[25], 动物实验所需脑片量大, 时间有限, 故选择冰冻切片漂片法行免疫荧光术。

　　首先需确定进行双标的2个一抗的种属来源。若来源不同, 双标可同时进行;若来源相同, 则必须分别标记。现具体介绍同时进行免疫的方法[26]。

　　(1) 漂洗:从冰冻保存液中取出脑片, 放入6孔板中用1×PBS洗5 min×6,(2) 封闭:用5%BSA室温封闭切片1 h,(3) 一抗混合液孵育:加入一标、二标一抗混合液37℃孵育1 h后, 4℃孵育过夜,(4) 漂洗:脑片经1×PBS漂洗5 min×3。加入一标二抗37℃孵育2 h, 注意避光,(5) 二抗混合液孵育:加入一标二抗、二标二抗混合液37℃孵育2 h, 注意避光,(6) 贴片与封片:1×PBS漂洗5 min×3后脑片转移至载玻片上, 避光自然晾干;滴加适量的防淬灭剂后, 盖上盖玻片, 激光共聚焦显微镜下观察。

　　3 其他

　　3.1 脑立体定位显微注射

　　情志病证研究与脑密切相关, 而脑立体定位显微注射则是一项必要且重要的技术, 广泛应用于各种与脑相关的研究中。其具体操作流程[27]如下:

　　(1) 麻醉:3%戊巴比妥钠 (80 mg/kg体质量) [7]腹腔注射行深度麻醉,(2) 固定:按照George Paxinos和Charles Watson (第六版) [28]的大鼠脑立体定位图谱的规定, 采取平颅头位固定法, 利用动物双侧内耳孔与门齿三点进行固定, 调整定位仪牙托位置, 使其垂直位置在两耳杆连线水平面以下 (3.3±0.4) mm, 前囟和后囟在同一水平高度,(3) 手术:大鼠头部剃毛消毒, 沿矢状线作一正中切口, 剥离筋膜, 暴露颅骨, 使颅骨骨缝清晰暴露, 找到前、后囟点,(4) 定位、注射:脑立体定位仪连接微量注射针, 将前囟点三维坐标归零作为零点。参照《大鼠脑立体定位图谱》定位注射部位的坐标, 颅骨钻对定位坐标点进行钻孔, 剥离硬脑膜, 将微量注射针送入注射部位, 微量注射泵定时定量连续注入所需物质。注射结束后静置10 min,(5) 恢复:牙科水泥固定钻孔, 缝合伤口, 手术区域注射青霉素预防感染。术后腹腔注射青霉素连续3d;每天监视切口是否有任何分泌物、红肿或开裂现象。

　　3.2 微电极技术

　　微电极技术的诞生把人们对神经电的认识带入了新的时代, 神经电生理记录技术已经成为研究神经功能的重要手段。其步骤[29]: (1) 脑立体定位:方法同3.1,(2) 电信号采集系统的连接:将含2%滂胺天蓝的6.8%醋酸钠溶液注入到拉制好的玻璃微电极 (阻抗为10~20 MΩ) 内, 静止数秒后充满尖端, 将直径0.6 mm的银丝插入到电极内, 另一端连接到放大器信号采集电极, 依次连接生物机能实验系统。参数设置:增益:1 m V, 时间常数:0.001, 高频率波:1 KHz, 采样率:10 KHz, 扫描速度:1.25 s/div。并将放大器参考电极放在大鼠耳上。同时音箱连结实时监控,(3) 插入电极记录电活动:将电极固定到立体定位仪上, 按照3.1的方法定位钻孔, 然后旋转下针, 当接触脑表面时要密切注视电极尖端, 确保顺利插入脑组织。定位坐标接近特定脑区时, 缓慢下针, 注意监听器声音变化, 当出现类似于外界干扰的剧烈电位变化, 或者是微弱的“劈劈啪啪”的声音 (清脆而节奏鲜明) , 即为记录到的神经元放电活动。

　　3.3 光遗传学技术

　　光遗传学技术是光学、遗传学和分子生物学技术结合后产生的一门新技术。这项技术主要是将光敏感蛋白表达在特定神经元中, 通过不同波长和频率的光刺激改变蛋白功能, 进而达到调控清醒动物脑内靶神经元功能的目的。其步骤是: (1) 植入光电极[30],(2) 光刺激和记录:植入光电极后数天, 待动物完全清醒后, 在进行光刺激的同时实时记录神经元的放电情况, 记录脑电图和进行机能性磁共振成像[31]。此外, 在体外, 在光刺激的同时, 用脑片电生理的方法记录神经元放电信号。

　　小结

　　近年来情志与疾病和健康的关系已成为中西医学共同关注的热点, 对情志病证的相关探索已成为当前国内医学、心理学界最为活跃的领域之一。而动物实验是生命科学研究中的重要组成部分, 已成为科学研究中的一个标杆[32]。适宜的实验技术在动物实验开展过程中则是至关重要的保障。

　　目前, 随着现代科技的飞速发展, 医学实验技术也不断发展、创新, 同时为科研提供了很大的帮助。然而, 却带来了很大的弊端 (信息泛滥、有用信息少之又少) 。在信息泛滥的今天, 对情志病证动物实验技术的阐述更是无系统、无标准。因此在情志病证动物实验开展的过程中, 困难重重 (耗时、耗力、耗财、结果不理想) 。本文在通过检索国内外文献, 并不断开展情志病证动物实验, 摸索并熟练掌握了情志病证相关的实验技术, 在此进行详细阐述, 以期为情志病证动物实验的开展提供技术支持, 从而为科研工作提供一定程度的便利。

　　参考文献
　　[1]乔明琦, 张惠云.中医情志学[M].北京:人民卫生出版社, 2009:36.
　　[2]Zimmermann M.Ethical considerations in relation to pain in animal experimentation[J].Acta Physiol Scand Suppl, 1986, 554:221-233.
　　[3]谭倩.白香丹对PMS肝气逆证模型大鼠不同脑区GABAB受体亚基分布表达及海马ERK1/2信号通路的影响[D].济南:山东中医药大学, 2012.
　　[4]Giachino C, Barz M, Tchorz J S.et al.GABA suppresses neurogenesis in the adult hippocampus through GABAB receptors[J].Development, 2014, 141 (1) :83-90.
　　[5]李慧, 黄景阳, 袁中瑞.提高脑组织冰冻切片质量的几点体会[J].中国免疫学杂志, 2012, 11 (28) :1019-1031.