芴对斑马鱼不同发育时期的毒性作用对比

　　芴( fluorene) 是美国国家环境保护局( USEPA) 优先控制的16 种多环芳烃( polycyclic aromatic hydrocar-bons，PAHs) 之一，是一种介于 2 环与 3 环之间的多环芳烃，主要来源于石油、木材、煤炭等的燃烧和海上石油开发运输中的泄漏。芴等多环芳烃会被水体中的悬浮颗粒物吸附，从而大量沉积在水底，但由于沉积物固相-水相间频繁的物质交换，沉积物中所吸附的PAHs 也会被沉积物中的底栖生物吸收，并通过食物链富集放大，进而大量富集于各种鱼类体内，最终危及到人类的健康并导致海洋生态平衡的破坏。

　　芴与萘在包括饮用水在内的国内外各种水体中被广泛检出，且国内水体中含量普遍高于国外。

　　斑马鱼( Brachydanio rerio) 的小规模饲养技术简单，遗传背景清晰，与人类基因组同源性高，常年产卵，鱼卵透明易收集，仔鱼发育迅速，对有毒化合物敏感。1996 年斑马鱼胚胎发育方法被经济合作与发展组织( OECD) 制定为测定单一化学品毒性的标准方法之一。近年来，国内外开始逐步利用包括斑马鱼在内的鱼类胚胎，研究 PAHs 的致畸性和作用机理，但多集中于萘、菲、苯并［a］芘等常见 2 环、3 环、5 环PAHs，对芴的研究较少。本研究采用芴对斑马鱼成鱼及2 个不同发育时期的斑马鱼胚胎进行染毒实验，研究其对斑马鱼的毒性效应，寻找芴对斑马鱼作用的最敏感时间与靶器官，旨在为进一步研究 PAHs 对鱼类不同发育阶段的毒性效应提供借鉴。

　　1、 材料与方法( Materials and methods)

　　1． 1 实验动物

　　产卵种鱼与急性毒性实验用鱼分批购买，分缸饲养，平均体长分别大于 4． 5 cm 与 2． 5 cm。种鱼于产卵前驯化 3 个月以上，实验用鱼驯化 1 个月以上。两缸饲养用水均为曝气自来水，溶解氧为( 9． 10 ±0． 08) mg·L-1，水温保持为( 26 ±1) ℃，pH 控制在 8左右，光照/黑暗周期控制为 14 h∶ 10 h。每天投喂经消毒处理的冷冻红虫饲料 2 次。

　　1． 2 试剂

　　芴( 99． 5%) 购自天津光复精细化工研究所，丙酮( 99． 5%) 购自天津江天统一科技有限公司。芴难溶于水，故需要选用助溶剂助溶。Hallare 等通过实验对比乙醇、二甲基亚砜、丙酮等助溶剂，证明丙酮对斑马鱼影响最小。本实验选用丙酮作为助溶剂，且通过实验发现当丙酮浓度小于 0． 5% ( 质量分数) 时，斑马鱼成鱼与胚胎发育不受影响。本实验最大助溶剂浓度不超过 0． 5%( 质量分数) 。

　　1． 3 实验方法

　　1． 3． 1 成年斑马鱼染毒实验设计　按照《危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》( GB/T21281—2007) 设计实验，以 1 000 mL 烧杯为受试用具，配制5 组质量浓度间隔较大的溶液 50、10、5、1、0． 5 mg·L-1，并设置不加毒物的空白对照组进行预实验。根据预实验结果，在96 h 绝对致死浓度10 mg·L-1与96 h 最大耐受浓度1 mg·L-1间，按等对数间距配制5 个浓度8．07、5． 30、3． 49、2． 30、1． 52 mg·L-1，同时设置未染毒空白对照。每个浓度放入 10 尾成年斑马鱼，每个浓度设置 3 组平行实验，以保鲜膜覆盖烧杯口，以免溶液挥发。采用静态置换法每天更新溶液的一半，以保证溶液浓度的稳定。更新溶液后，溶液中溶解氧浓度略有下降，稳定于( 7． 07 ±0． 22) mg·L-1。

　　观察24 h、48 h、72 h 和96 h 的成鱼活动和中毒症状，拍照并记录各时间段鱼类死亡数。

　　1． 3． 2 斑马鱼胚胎染毒实验设计种鱼在早晨给光 30 min 内完成交配，于倒置显微镜下选取发育正常鱼卵，用于毒性实验。共配制 50、10、5、1、0． 5、0． 1 mg·L-1共 6 组浓度的芴水溶液对鱼卵进行预染毒实验，根据预实验结果选取 5 个浓度( 10、8、5、2、1 mg·L-1) 进行正式实验。按照 Schulte 等的研究方法设计实验，选用24 孔细胞培养板作为鱼卵受试器具，每块细胞培养板为 1 个浓度，每孔容积 3 mL，实验时每孔加入 2mL 试剂，并置入 1 枚发育正常的鱼卵。24 孔中，前20 孔为同一浓度，后 4 孔为空白对照。将每块细胞培养板用保鲜膜封好，并放入事先设置好的温度为( 28 ±1) ℃，光暗比为 14 h∶ 10 h 的光照培养箱中。

　　考虑受试试剂对斑马鱼胚胎毒性作用时间的差异，鱼卵实验共进行 2 组，浓度相同，分别为 0 hpf( hourspast fertilization) 染毒组与 10 hpf 染毒组。10 hpf 染毒组实验鱼卵于普通饲养用水正常发育 10 h，之后将其置于细胞培养板中进行染毒实验。

　　在倒置显微镜下观察0 hpf 组鱼卵4 h 的卵凝结情况，之后与10 hpf 组实验鱼卵一起观察12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 时的发育变化与毒理学终点，并统计各实验组的斑马鱼胚胎的死亡数与死亡方式、孵化数以及各项毒理学指标。

　　1． 4 数据处理

　　计算得出各浓度下成鱼的死亡率和鱼卵出现的不同毒理学终点的概率，通过 PASW STATISTICS 18按照概率单位法计算成鱼的半致死浓度( LC50) 、胚胎各毒理学终点的半致死浓度( LC50) 和半效应浓度( EC50) ，并统计 36 h 各染毒组鱼卵胚胎心跳次数，按照单因素方差分析( ANOVA) 比较暴露组与对照组间的显著性差异，p ＜ 0． 05 被认为差异显著，p ＜0． 01被认为差异极显著。

　　2、 结果( Results)

　　2． 1 芴对斑马鱼成鱼的半数致死浓度

　　在染毒实验中，斑马鱼随染毒浓度不同出现不同程度中毒症状: 初入不同浓度的染毒溶液，斑马鱼均潜入水底，且活动迟缓，呈现麻痹状态，且当对烧杯壁进行敲打时，斑马鱼反应速度明显变得迟钝。

　　随染毒时间的增加，较低浓度组( 1． 52、2． 30 mg·L-1)成鱼逐渐恢复活力，基本可以正常游动，而高浓度组( 5． 30、8． 07 mg·L-1) 成鱼的呼吸变得极为急促，失去水中平衡能力，出现侧翻侧泳现象，部分鱼类在水中呈现与地面垂直直立状，并逐渐抽搐而死( 见图1a) 。死亡鱼体鳃部及心脏部明显红肿，且鱼体脱色严重，几近白色，高浓度组( 8． 07mg·L-1) 鱼体脊椎反向弯曲严重( 见图 1b) 。成鱼各时间段 LC50见表 1，LC50值随染毒时间增加，缓慢降低，表明 96 h 内暴露时间越长，芴的毒性愈明显，这说明芴对生物体的毒性大小受暴露时间影响。

　　

　　芴对成年斑马鱼的 96 h-LC50约为 3． 6 mg·L-1。根据 GB/T 21281—2007 的标准，芴对成年斑马鱼的96 h-LC50在1 ～10 mg·L-1之间，其毒性为急性Ⅱ类标准。

　　2． 2 芴对不同染毒时间的斑马鱼胚胎半数致死浓度的比较

　　斑马鱼胚胎前 12 h 主要死亡方式为卵凝结( 图1d) ，在 12 h 后部分胚胎出现发育阻滞，之后停止发育，胚胎随时间推移逐渐变得模糊不清，最终溃烂解体。0 hpf 与 10 hpf 这 2 组的 LC50结果见表 2，可以看出 0 hpf 组各 LC50值中，4 h-LC50最高，达到 17． 08mg·L-1，72 h-LC50最低，为 5． 88 mg·L-1。其余各时间段 LC50值随染毒时间增加而降低，且在 4 h 到 12 h之间有一个较大的下降过程，之后逐渐趋于稳定。

　　这表明随着染毒时间的增加，斑马鱼胚胎对芴的致死敏感性逐渐减小，在前 12 h 芴对斑马鱼胚胎死亡率变化影响较大，12 h 后死亡率趋于稳定。10 hpf组由于在受精后 10 h 开始染毒，该组在 12 h( 染毒后 2 h) 观察时并无鱼卵死亡，故 12 h 时间点无值，预计此点 LC50值远大于 24 h 的 28． 89 mg·L-1。此组实验，除高浓度组( 8、10 mg·L-1) 在 24 h 出现少数死亡鱼卵，之后各浓度组并无鱼卵继续死亡，故 24 h、48 h、72 h 这 3 个时间点 LC50相等，均为 28． 89 mg·L-1。

　　2． 3 芴对不同染毒时间的斑马鱼胚胎半数效应浓度的比较

　　本实验中0 hpf 与10 hpf 这2 组观察到的针对斑马鱼胚胎的非致死类指标包括:24 h 发育阻滞( 图1f) 、24h 无主动运动、36 h 心率异常、48 h 心包囊肿( 图 1g) 、48h 卵黄囊水肿，72 h 心包囊肿( 图 1h) ，72 h 脊柱弯曲( 图1i) 等。由于72 h 畸形这2 项指标成个例出现，不具备统计学价值，故主要分析其余5 项非致死类指标，各项指标发生的半效应浓度( EC50) 见图2。

　　

　　由图 2 可以看出，0 hpf 组 36 h 心率异常为斑马鱼胚胎最敏感的指标，其 EC50为 2． 15 mg·L-1，最不敏感指标为 24 h 发育阻滞，其 EC50为8． 99 mg·L-1，0hpf 组各指标敏感性依次为 36 h 心率异常 ＞ 48 h 心包囊肿 ＞24 h 无主动运动 ＞48 h 卵黄囊水肿 ＞24 h发育阻滞。10 hpf 组中，24 h 无主动运动、36 h 心率异常、48 h 心包囊肿三者 EC50值较为接近，分别为6． 61、7． 64、6． 41 mg·L-1，3 项指标的值均远低于24 h发育阻滞，这表明它们对芴的非致死效应敏感性均远高于 24 h 发育阻滞。10 hpf 组的 5 项指标的 EC50值均在不同程度上高于 0 hpf 组的所对应指标的EC50值，这是由于 10 hpf 组染毒时间短，毒性蓄积量较小，从而 EC50值较高。但 10 hpf 组相对于 0 hpf组，各指标 EC50的增量并不呈比例关系，这一点还有待进一步分析。

　　2． 4 芴对斑马鱼胚胎心率的影响

　　各浓度下 0 hpf 和 10 hpf 组的 36 h 胚胎心率见图 3 和图 4。从这 2 个图可知，相对于对照组，斑马鱼胚胎的心率经不同浓度的芴水溶液染毒后均受到一定程度的抑制，且抑制率随浓度增大而增大。其中，0 hpf 斑马鱼胚胎的各染毒组，1 mg·L-1与 2 mg·L-1这 2 个低浓度组与对照组无显著性差异，5、8、10mg·L-1这 3 组与对照组差异极显著( p ＜0． 01) ，相对于对照组的抑制率分别达到 30． 1%、41． 3%、35．8% ，0 hpf 斑马鱼胚胎的 8 mg·L-1染毒组中，心率抑制率达峰值，继续增加浓度不会导致心率抑制率增加。同时8 mg·L-1组标准偏差值最大，这是由于斑马鱼个体存在差异，对芴毒性的抵抗性不同，因此心率被抑制的程度也有所不同。10 hpf 斑马鱼胚胎的各染毒组中，1、2、5 mg·L-1这 3 组与对照组相比，心率均无显著性差异，但1 mg·L-1组出现部分心率大于对照组的胚胎，这是由于较低含量的芴在胚胎体内蓄积，引起了斑马鱼胚胎心率的应激反应。8 mg·L-1组与 10 mg·L-1组与对照组相比，存在显著性差异( p ＜0． 05) ，心率抑制率达到 12． 6% 和 20． 6% 。芴对 10hpf 组的心率影响小于对 0 hpf 组的心率影响，这可能是由于 10 hpf 组染毒时间较短，胚胎体内芴的蓄积量要小于 0 hpf 组的缘故。

　

　　3、 讨论( Discussion)

　　有机污染物毒性作用可分为麻醉型毒性和反应型毒性 2 种。几乎所有有机物对生物都表现出基本的致麻醉作用，这种麻醉作用一般被称为基本毒性。麻醉毒性一般又分为非极性麻醉和极性麻醉2 种。非极性麻醉型化合物能够穿透细胞膜，并破坏细胞膜的功能，从而从内部影响细胞的正常运行。

　　而极性麻醉型化合物通常为分子结构中具有强失电子的氨基、羟基的芳烃化合物，其毒性一般高于基本毒性。在本研究中，成年斑马鱼在不同浓度的芴溶液中均呈现麻痹状态，分析芴的分子结构，为介于2 环与 3 环间的多环芳烃，并不包含氨基、羟基等强失电子结构的基团，因此推测芴对斑马鱼成鱼的主要毒性机理为非极性麻醉。这也与 Inacardona 等推测的结果相符合，他对 3 环 PAHs 菲进行深入研究，发现其机制是在生物膜内大量蓄积的化合物破坏了细胞双层脂膜的功能，并进而导致心脏功能的紊乱，其毒性属于非极性麻醉效应。这也说明介于 2环与 3 环间的 PAHs 芴与 3 环 PAHs 菲的毒性相似。

　　Charles 等将斑马鱼胚胎的发育定义为 7 个阶段: 合子、卵裂、囊胚、原肠、分节、咽囊以及孵化期。分别对应的胚胎发育时间为 0 h、0． 75 h、2． 25h、5． 25 h、10 h、24 h、48 h。通过对比 0 hpf 组与 10hpf 组胚胎 LC50变化的差异，发现经过相同时间的染毒，LC50变化比例并不相同，这表明斑马鱼胚胎发育不同阶段对芴的致死敏感性并不相同。同时 0 hpf组各时间点的 LC50远小于 10 hpf 组，这也说明 0 hpf组鱼卵对芴的致死敏感性远大于 10 hpf 组，因此推断芴对斑马鱼胚胎的毒性效应主要发生在胚胎受精后的前 10 h，即分节期之前。成鱼、0 hpf 组、10 hpf组斑马鱼的 48 h-LC50分别为 4． 013、6． 074、28． 980mg·L-1。可以看出三者对芴致死性效应的敏感性为成鱼 ＞ 斑马鱼胚胎 0 hpf 染毒 ＞ 斑马鱼胚胎 10 hpf染毒。这可能是由于相较于成年斑马鱼，斑马鱼胚胎存在卵膜，其在斑马鱼体外又形成了一层屏障。

　　故斑马鱼成鱼比斑马鱼胚胎对芴的直接染毒更为敏感。而且胚胎卵膜自身也随发育时间的增加，变得可以抵御水体中较大浓度的芴，这也可以解释分节期前的斑马鱼胚胎对芴的致死性效应具有更高的敏感性，而分节期后斑马鱼胚胎具有更大的耐受性。

　　分析斑马鱼胚胎出现的各毒理学终点，0 hpf 组在染毒 4 h 后，部分胚胎出现卵凝结现象( 图 1d) ，这可能是由于在芴的影响下胚胎在进入原肠期前就停止发育，并使胚盘细胞损毁并逐渐裂解所引起的。

　　胚胎内包含用于调控 PAHs 代谢、解毒与致毒过程的细胞色素 P450 1A 酶，在胚胎发育初期，由于卵膜发育得并不完善，导致胚胎内部蓄积了大量的芴，机体的大量能量被用于芴的解毒上，从而暂缓了胚胎的发育，形成发育阻滞现象( 图 1f) 。芴在斑马鱼胚胎体内的积累也可能影响胚胎的发育，造成胚胎的死亡，与血液循环系统的畸形，包括心率异常与心包囊肿( 图 1g) ; 同时也会使初生的仔鱼发育畸形( 图1h 和图 1i) 。芴对斑马鱼胚胎最敏感的指标为心率异常与心包囊肿。因此，推断芴对斑马鱼胚胎染毒的靶器官为心脏组织，其主要会引起心率异常与心包囊肿等病症。穆景利等和何欣的研究也分别表明了萘和菲会引起相似的症状。

　　在实验观察中可以发现，斑马鱼胚胎出现的非致死性指标包括心率异常、心包囊肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲等现象，与蓝囊综合症( blue sac disease，BSD) 的症状相似。BSD 通常是由二噁英类化合物( dioxin-like compounds，DLCs) 引起的。目前对于DLCs 的研究较多，通常认为其作用方式是与芳香烃受体结合形成异二聚体，影响 mRNA 的转录，最终影响蛋白表达及酶的响应，产生毒性作用。考虑症状相似，推测芴的毒性作用方式除非急性麻痹作用外，可能与 DLCs 作用方式有类似之处，其具体毒性机理有待进一步研究。