微卫星标记检测大白猪和长白猪种群的遗传多样性

　　当今世界大白猪和长白猪是最重要的商业品系肉用猪，尤其以生长速度快、繁殖力高、适应性强和瘦肉率高的特点而被人们所熟知，它是世界上最着名，分布最广的主导瘦肉型猪，全世界范围内均有饲养[1 -3].据调查，国内外很多特有小型猪，如广西巴马小型猪、西藏小型猪、甘肃蕨麻猪、Yucatan 小型猪等，作为实验动物模型广泛应用于动物医学、科学研究、器官移植等诸多方面[4 -7];而长白猪，杜洛克和大白猪等为重要的肉用型品种多用于经济性状的选育和保种[8],用于 SPF 级实验动物模型研究更是鲜有报道。而中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从加拿大引进 100 头无猪瘟、猪呼吸综合征、猪传染性胃肠炎、猪流感等病原体的 SPF 猪主要应用于实验动物，其中大白猪和长白猪各 50 头包含 32 窝大白猪和 28 窝长白猪。随猪附赠系谱材料显示该种群可追溯至其 10代以内的血缘关系，引进之后继续对它们进行封闭环境饲养，已繁育一代。运用微卫星标记技术检测两个种群的遗传多样性明确其遗传背景为实验动物化提供理论依据。现拟向哈尔滨市及周边多个猪场、科研机构和生物制药物企业提供标准的实验动物素材为猪病的研究和疫苗的制备提供良好的实验动物材料。

　　微卫星标记（ microsatellite） ,又称为短串联重复（ short tandem repeats,STRs） 或简单重复序列（ sim-ple sequence repeats,SSRs） ,由 2 - 6 个核苷酸串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体和品种间呈高度变异而产生数量丰富的等位基因（ 或基因型） ,广泛应用于动植物优良性状的选育和标记，如稻米的淀粉品质、猪的主要经济性状的选育与标记[9 -11].在家畜育种和亲子鉴定（ 包括个体来源、品 种 来 源、个 体 或 品 种 间 的 亲 缘 关 系 鉴定）[12 -14]中有着重要意义。

　　1 材料与方法。

　　1. 1 样品采集。

　　98 份猪耳组织样本，引自加拿大，均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牧场。其中大白猪和长白猪各 49 头，所采耳组织样品均置于无菌的 1. 5mL EP 管中带回实验室，- 20℃ 冰箱保存备用。

　　1. 2 实验试剂。

　　2 × Taq PCR Starmix 聚合酶购自 GenStar,小剂量基因组 DNA 提取试剂盒购自 Axygen 公司。引物根据联合国粮农组织（ FAO） 和国际动物遗传学会（ ISAG） 联合推荐的 30 对微卫星引物中，依据等位基因数的丰富程度、分布在不同染色体的原则，选取了其中的 19 个微卫星位点，实际实验扩增过程中部分位点的退火温度和扩增后分析范围进行微调（ 见表 1） ,由北京金唯智公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　1. 3 基因组 DNA 的提取。

　　按照 Axygen 小剂量基因组 DNA 提取试剂盒说明书提取猪耳组织基因组 DNA.将 DNA 溶于去离子水，用 NanoDrop-100 紫外分光光度计测定浓度和纯度，然 后 用 去 离 子 水 稀 释 至 20 ng/μL,置 于- 80℃ 冰箱冻存备用。

　　1. 4 PCR 扩增与检验。

　　根据扩增片段的理论值大小，每组位点中的片段大小相差至少10 ~25 bp,并且标记的荧光颜色不发生重叠，将19 对微卫星引物分为6 组。PCR 反应体系为 20 μL: 上、下游引物各 1 μL（ 10 mmol/L） ,2× Taq PCR Starmix 聚合酶 10 μL,模板 DNA 1 μL,ddH2O 7 μL.反应条件为： 94℃ 预变性 5 min; 94℃变性 30 s,55℃ ~65℃退火（ 分组及不同引物的 Tm值见表 1） 30 s,72℃延伸 30 s,30 个循环； 最后 72℃延伸7 min,10℃保存。扩增产物按组混合加样进行凝胶毛细管电泳检验，并用 GeneMapper V4. 0 软件进行荧光数据提取、分子量标准设定和 PCR 产物片段大小的计算，最后根据核心碱基数完成基因型的判定。

　　1. 5 统计分析。

　　采用 Excel Microsatellite Toolkit V3. 1 软件，计算大白猪和长白猪在 19 个微卫星位点上的等位基因数、杂合度、多态信息含量。利用 Genepop V1. 2软件进行群体间的遗传分化和基因型差异的分析[15].利用 FSTAT V2. 9. 3 进行 F-检验[16].利用Structure V2. 3 软件分析大白猪和长白猪的遗传分化结构图，所设参数“Burnin Period”和“After Bur-nin”均为 50 000 次，K 值为 2 - 5,然后利用 distruc-ture 软件显示图形。