不同剂量照射方式下大鼠放射性肺损伤情况分析

　　不同程度放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗后常 见的并发症，限制了胸部肿瘤放疗剂量提升致肿瘤控制率下降，同时严重影响患者生存质量[1],严重者成为非肿瘤致死因素。尽管近年来放疗设备不断更新及放射技术不断完善，但放射性肺损伤发生率仍然较高[2-3]且缺乏有效治疗措施，因此放射性肺损伤一直成为研究的焦点之一。本研究拟采用单次大剂量和分次照射大鼠双肺，通过比较照射后肺组织动态病理变化、肺组织 TGF-β1 表达、血清 TGF-β1 含量测定，为研究放射性肺损伤提供可靠的大鼠动物模型。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验动物及分组

　　健康 SD 大鼠 85 只，照射前后均饲养于江西中医药大学教育部重点实验室，随机抽签分为对照组 15 只（ A 组） 、单次照射组 35 只（ B 组） 、分次照射组 35 只（ C 组） .

　　1. 2 照射方法

　　速眠新Ⅱ1 ml 肌肉（ 腹腔） 全身麻醉后，5 只大鼠并排仰卧固定于自制老鼠板上，在 X 线模拟机下确定照射野（ 双肺照射） : 上界为肺尖，下界为肋膈角，左右漏空，射野大小一般为 4. 5 cm × 20 cm.采用西门子Primus 高能直线加速器 6MV X 线进行垂直照射，放置2 cm 厚补偿膜，源皮距 100 cm,深度 3. 5 cm,剂量率 3Gy / min,A 组大鼠麻醉后佯装照射，B 组大鼠单次照射（ 15 Gy） ,C 组大鼠分次照射（ 3 Gy/次，2 次/周 × 3周） .

　　1. 3 取材及处理

　　于照射后第 1、3、5、8、12 周末 5 个时相点随机活杀 A 组大鼠3 只、B 组及 C 组大鼠各7 只，经股动脉留取大鼠血液 3 ~ 5 ml,4 ℃下静置待凝固后 3 500 转/分，离心 5 min 取上清贮存于 -70 ℃冰柜内备用。剖开胸腔分离主支气管，快速将气管及双肺剥离出胸腔，观察肺的大体结构改变。选取右肺中叶组织用 10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm 连续切片，HE 常规染色比较观察各组肺组织病理组织结构改变。采用免疫组化法检测肺组织 TGF-β1 表达。

　　1. 4 免疫组化结果判断标准

　　阴性（ -） : 胞质中无颗粒沉着； 弱阳性（ + ） : 胞质中淡黄色细颗粒沉着； 阳性（ + + ） : 胞质中棕黄色颗粒沉着； 强阳性（ + + + ） : 胞质中褐黄色粗颗粒沉着。

　　阴性和弱阳性归为阴性结果； 阳性和强阳性归为阳性结果。

　　1. 5 血清 TGF-β1 含量测定

　　备用大鼠血清在室温下融化后 2 h 内采用 ELISA法测量 TGF-β1 含量（ ng/ml） ,测量试剂盒由美国 ADL公司生产，操作步骤严格按说明书要求进行。

　　1. 6 统计软件和方法

　　应用 SPSS 15. 0 统计软件进行分析，组间阳性率计数资料比较采用配对 χ2检验，P <0. 05 时被认为有统计学意义。

　　2 结果

　　实验期间，共有 8 只大鼠死亡，其中 A 组无死亡，B 组 7 只，C 组 1 只，最早死亡发生在照射后 3 周，死亡集中在 3 ~8 周之间，死亡大鼠同样取右中肺组织。

　　B 组大鼠在照射后精神差、活动少、体重下降，C 组大鼠照射后在精神、活动及体重方面与照射前变化不明显。

　　2. 1 肺大体标本观察

　　各时间点 A 组大鼠肺表面均光滑，呈粉红色，弹性良好。B 组、C 组大鼠于照射后第 1 周肺组织稍有肿胀，表面见少量散在点状出血； B 组、C 组大鼠分别于照射第 3 周、5 周后肺的颜色由鲜红色逐渐变为暗红色，颜色进行性加深，且肺组织有肿胀。B 组大鼠照射后第 8 周、第 12 周肺体积明显缩小，表面呈灰白色，可见凹凸不平结节，质地硬，弹性明显降低，而 C 组大鼠于照射后第 12 周出现上述外观改变。

　　2. 2 HE 染色组织学观察

　　A 组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄而光滑，血管正常，肺泡腔完整，腔内无渗出物。B 组大鼠照射后第1、3 周及 C 组大鼠照射后第 3、5 周可见肺泡充气不良，肺泡壁轻度水肿，毛细血管充血，肺泡腔内可见少量渗出及较多中性粒细胞浸润，间隔无明显渗出、充血和水肿。B 组大鼠照射后第 3、5 周及 C 组大鼠照射后第 5、8 周可见肺泡间隔增宽，肺泡间隔及部分肺泡腔内可见纤维素样的渗出物及大量单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，肺组织中可见散在的体积缩小变圆、胞质红染、胞核固缩蓝染似凋亡的细胞，与坏死的细胞较难区别。B 组大鼠照射后第 8、12 周可见肺泡间隔进一步增宽，肺泡间隔破坏，可见到由梭形成纤维细胞构成的成纤维病灶，胶原纤维呈带状，大部分肺泡腔塌陷、不张。肺内病变轻重不一，可见肺实变，C组大鼠仅于照射后第 12 周出现上述改变。

　　2. 3 各组大鼠血清 TGF-β1 含量比较

　　A 组大鼠血清 TGF-β1 含量在各时相点平稳，B 组及 C 组大鼠血清 TGF-β1 含量依顺序时相点持续升高，于第 12 周达峰值，均显着高于 A 组（ P <0. 05） ,B组稍高于 C 组，比较无差异（ 图 1） .

　　2. 4 各组大鼠肺组织 TGF-β1 免疫组化结果比较
　　
　　A 组大鼠肺组织 TGF-β1 表达分别在第 3 周及第8 周出现 1 只阳性。而 B 组及 C 组各时相点大鼠肺组织 TGF-β1 表达阳性表达数目从第 1 周至第 12 周均呈上升趋势（ 图2） .A 组与 B 组及 C 组大鼠肺组织各时相点 TGF-β1 表达阳性率比较均有显着性差异（ 表1） ,B 组与 C 组大鼠肺组织各时相点 TGF-β1 表达阳性率比较，差异无显着性。【1】

　　
　　3 讨论

　　放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗常见的并发症，是影响患者放疗的主要剂量限制性因素[4],目前临床上缺乏有效的防治措施，因此放射性肺损伤防治研究是医学研究的热点领域之一。成功建立动物放射性肺损伤模型是研究防治放射性肺损伤关键的第一步，陆忠华等[5]在建立小鼠放射性肺损伤模型研究中，以肺大体标本变化、染色组织学检查及肺组织TGF-β1 含量等作为鉴定指标，成功复制出了典型的放射性肺损伤小鼠动物模型。

　　另外不乏建立放射性肺损伤模型的研究[6-8],但鲜有采用与临床放射治疗相似的分次分割照射方式建立放射性肺损伤模型的研究。本研究试图以两种分割方式照射大鼠双肺建立放射性肺损伤动物模型，合理评估两种分割照射方式建立放射性肺损伤动物模型的可行性、科学性及实用性。

　　本研究中，在照射大鼠双肺后，以肺大体标本变化、HE 染色组织学检查及肺组织 TGF-β1 表达、血清TGF-β1 含量进行放射性肺损伤的鉴定。结果显示，通过大体标本观察及 HE 染色组织学检查，单次照射组和分次照射组大鼠肺组织学改变均经历一个不能完全分开的连续过程，分别为急性炎症期（ 肺泡壁水肿，毛细血管充血，肺泡腔内可见渗出液） 、增生期（ 肺泡间隔增宽，肺泡间隔及部分肺泡腔内见纤维素样渗出物及单核巨噬细胞） 及纤维化期（ 肺泡间隔进一步增宽并破坏，见由梭形成纤维细胞构成的成纤维病灶，胶原纤维呈带状，肺泡塌陷、不张） ,与国内外[9-10]研究得出的放射性肺损伤病变规律和特点一致。TGF-β1 广泛存在机体各组织中，可抑制实质细胞的增值，促进纤维母细胞和成骨细胞增值，刺激细胞增加基质合成、减少基质降解[11].动物试验和临床观察资料提示胸部肿瘤放疗后 TGF-β1 的变化和放射性损伤的发生明显相关，均证明 TGF-β1 在放射性损伤发生发展过程中起着重要作用[12-13].故通过检测肺组织 TGF-β1 表达水平及其血清含量可反映放射性肺损伤的发生及程度。

　　本研究结果显示，B 组和 C 组大鼠双肺照射后，肺组织TGF-β1 阳性表达率及血清 TGF-β1 含量依顺序时相点逐渐升高，于第 12 周达到最高峰，与 A 组各相应时相点结果比较有显着差异，单次照射组稍高于分次照射组，比较无差异。且血清 TGF-β1 含量绝对数值与各时相点放射性肺损伤严重程度相对应。病理免疫组化和 TGF-β1 检测结果均提示单次照射方式和分次照射方式均成功建立了放射性肺损伤动物模型。

　　对放射性肺损伤稳定性进行分析，分次照射组、对照组存活率分别为 97% （ 34/35） 、100%,明显高于单次照射组存活率（ 80%） ,分次照射建立的放射性肺损伤动物模型利于较为长期的实验观察，对实验结果影响小。

　　综上所述，单次及分次照射大鼠肺组织均能建立可靠的放射性肺损伤动物模型，符合病变规律及特点。

　　大鼠全肺照射野容易控制，单次照射简单，不影响临床工作，可用于短期试验研究； 分次照射更符合临床放疗常规分割，死亡率低，可行性良好，分次照射利于长期试验研究。