斑马鱼早期胚胎背腹发育中ripply1的作用

　　胚轴（ embryonic axes） 形成是多细胞生物躯体模式（ body plan） 建立的一个重要过程，主要包括前- 后轴 （ anterior-posterior axis ） 、背 - 腹轴 （ dorsal-ventral axis） 和左 - 右轴（ left-right axis） .对两栖动物胚胎的研究发现背 - 腹轴早在受精后即可观察到，如爪蛙胚胎皮层转动形成的灰色新月区在后期发育成背部。德国发育生物学家 Hans Spemann 和他的学生 Hilde Mangold 将原肠早期蝾螈胚胎的背部组织移植到另一种蝾螈胚胎的腹部，得到了形成双体轴的胚胎，次级体轴的脊索来自于供体胚胎，而神经管和体节多数来自于受体，这说明该背部组织能诱导周围受体胚胎的细胞形成神经管，首次提出了胚胎诱导的概念并称该背部组织为组织者（ or-ganizer） .

　　ripply 家族蛋白在 2005 年被发现并揭示了其部分功能[1],研究发现 ripply1 和 ripply2 特异表达于体节，其中 Ripply1 蛋白与转录辅抑制因子 Groucho 结合，能够终止分节基因的表达，维持体节的前后极性。之后对 ripply1 的研究都集中在其在体节时期对体节发生的作用，而其在早期胚胎模式发生的作用却研究甚少。但最近在爪蛙中的研究发现 ripply家族蛋白能通过其 WRPW 区域结合多梳蛋白（ Polycomb group proteins） 起转录去抑制的作用，并且在背 - 腹轴形成过程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎发育早期的表达图式和调节方式还不清楚。并且，ripply3 是人的唐氏综合征关键区域基因 6（ Down syndrome critical region gene 6,dscr6） 的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用机制能为人类遗传疾病的致病机理提供信息。我们通过原位杂交技术发现 ripply1 在斑马鱼早期胚胎中特异表达在背部，因此推测其可能参与背腹发生。故而通过过 表 达 ripply1,并 调 取1. 2 kb的启动子片段，初步研究其在胚胎早期背腹发生的作用。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　AB 品系的斑马鱼养殖在 28. 5℃ 的循环水系统中，如早期工作所描述[4].

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 获取 ripply1 cDNA取斑马鱼胚盾（ shield） 时期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎总 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒反转录，详细步骤参见使用说明书。

　　1. 2. 2 斑马鱼 ripply1 整胚原位杂交调取 ripply1 全长 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶扩增后将其连入 pGEM-T 载体中。根据测序方向合成地高辛标记的反义 RNA 作为探针使用。其他探针如goosecoid （ gsc） 、chordin （ chd） 、floating head （ flh） 、even-skipped-like 1 （ eve1） 、T-box6 （ tbx6） 、wnt8a 详见作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反义 RNA 用原位杂交液 hyb+（ 50%甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20,0. 5 mg/mL酵母 RNA,0. 05 mg/mL 肝素） 稀释至 1 ng/μL.收集不同时期的斑马鱼胚胎，固定于 4% 多聚甲醛中过夜。过渡到含 0. 1% Tween-20 的 PBST 中，并在PBST 中将胚胎膜剥去，用 PBST 洗过后在原位杂交液 hyb-（ 50% 甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20） 中65℃ 孵育 10 min,之后在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探针 60℃ 孵育过夜。第 2 天吸出探针以重复使用。